dc.description.abstract | El mantenimiento de la integridad del genoma es esencial para el correcto
funcionamiento de las funciones celulares así como la transmisión de la información
genética a través de las generaciones. La inestabilidad genética es una patología
celular que puede originarse como consecuencia de agentes genotóxicos exógenos
que pueden modificar o dañar la estructura del ADN. En otras ocasiones son fallos en
los propios procesos endógenos de la célula como la replicación, la transcripción o la
reparación de daños en el ADN los pueden dar lugar a cambios y mutaciones en las
secuencias del ADN. La inestabilidad genética está asociada a tumorogénesis,
envejecimiento y enfermedades genéticas, por lo que el estudio de su origen es
esencial en el avance de la biomedicina.
Las estructuras llamadas bucles R o R loops surgen co-transcripcionalmente y constan
de un híbrido de ADN:ARN y una cadena de ADN simple desplazada. Aunque los R
loops tienen importantes funciones fisiológicas, como en la replicación del ADN
mitocondrial o en el cambio de isotipo de las inmunoglobulinas, se ha demostrado que
cuando la formación o acumulación de estas estructuras es anómala, puede dar lugar
a distintos tipos de inestabilidad en el genoma. Esto se debe a que por un lado pueden
suponer un obstáculo para la maquinaria replicativa y por otro lado, la cadena sencilla
de ADN está expuesta a sufrir distintos tipos de mutaciones y alteraciones. Es por ello
que las células han desarrollado mecanismos para evitar o eliminar los R loops. Uno
de estos factores es la proteína Hpr1/THOC1, miembro del complejo THO involucrado
en la formación de las ribonucleopartículas (hnRNP). Se ha observado que este factor
es clave para impedir la formación de híbridos ADN:ARN durante el proceso de
transcripción ya que la hnRNP evita la hibridación del mensajero naciente con la
cadena de ADN molde durante la trascripción. Por otro lado, la helicasa Sen1/SETX,
actúa en la resolución directa de los híbridos de ADN:ARN, siendo también un
elemento importante es el mantenimiento de la estabilidad genómica.
En esta tesis nos hemos centrado en estudiar más profundamente los efectos de la
eliminación controlada de las proteínas anteriormente mencionadas. Para ello, hemos
generado cepas de Saccharomyces cerevisiae con un sistema de degradación
inducible, capaces de activar la degradación de Hpr1 o Sen1 de manera controlada y
rápida. Esto ha permitido evitar los fenotipos de adaptación anteriormente observados
en estirpes mutantes en estos factores e indagar en los mecanismos que dan lugar a
la inestabilidad genómica en ausencia de Hpr1 o Sen1. Mediante el uso de estas
nuevas herramientas genéticas hemos sido capaces de reproducir fenotipos de
inestabilidad ya conocidos, cómo la acumulación de daño en el ADN e hiperrecombinación,
así como definir nuevos fenotipos como retraso en la progresión del
ciclo celular debido a defectos en replicación. Lo que es mas importante hemos
observado diferencias entre las dos cepas en cuanto a la acumulación de R loop a lo
largo del ciclo celular. Finalmente hemos identificado y correlacionado a nivel de todo
el genoma sitios de acumulación de R loops y marcas de acumulación de daño en el
ADN.
En el segundo capítulo hemos utilizado una colección de 400 mutantes viables de S.
cerevisiae para encontrar nuevos elementos asociados a la homeostasis de los
híbridos ADN:ARN. Con este fin, hemos sobre-expresado la proteína Yra1, que
provoca un aumento en los fenotipos de inestabilidad asociados a R loop. Yra1 tiene
como sustrato el ARNm, pero si se encuentra en exceso en la célula, podría estabilizar
los híbridos, dando lugar a la inestabilidad asociada. Mediante el uso de esta
herramienta hemos identificado varios candidatos, entre ellos Nsr1, un factor nucleolar
con funciones relacionadas con la biogénesis de ribosomas y capaz de interaccionar
con el ARN. Hemos observado que la deleción de Nsr1 causa la acumulación de R
loops principalmente en el ADN ribosómico, provocando fenotipos de inestabilidad
asociados como aumento en las frecuencia de recombinación o problemas de
replicación del cromosoma XII. Los resultados obtenidos nos han permitido establecer
un modelo por el cual Nsr1 sería capaz de controlar la acumulación aberrante de R
loops en el ADN ribosómico y evitar sus efectos deletéreos en la célula.
Finalmente, en el último capítulo, nos hemos centrado en el estudio de modificaciones
post-traduccionales en la cromatina y su relación con los híbridos de ADN:ARN. Para
ello, se decidió extender el estudio de estas modificaciones de histonas a células
humanas y C. elegans. Además de explorar más a fondo la fosforilación de la serina
10 de la histona H3 (H3S10ph) y su conexión con los híbridos, hemos descubierto que
la modificación H3T3ph, que es la primera fosforilación en la cascada de
modificaciones que activan la condensación de la cromatina, también está
desregulada en mutantes que acumulan R loops. Esto abre un nuevo frente en la
conexión entre R loops y remodelación de la estructura de la cromatina.
En conclusión, los resultados obtenidos en esta tesis doctoral revelan el papel de
distintos elementos celulares en el metabolismo de híbridos ADN:ARN y su
importancia para controlar la acumulación de estas estructuras en el genoma para
preservar su integridad. | es |