Genetic and molecular analysis of the salmonella effector SrfJ and use of type III secretion effectors as carriers for heterologous vaccine design.

Abstract

Salmonella enterica is a species of bacterial pathogens that can produce different diseases from gastroenteritis to typhoid fever. Salmonella possesses two different virulence-related type III secretion systems (T3SSs) that are key elements in the interaction with the host cell. These systems mediate the translocation of effector proteins into the cytosol of the host cell where they interfere with different cellular processes to allow the pathogen entry and its survival inside vacuoles. We studied the S. enterica serovar Typhimurium SrfJ effector expression. We provide evidence for the existence of two distinct promoters that control the expression of srfJ. A proximal promoter, PsrfJ, responds to intravacuolar signals inside mammalian cells and is positively regulated by SsrB and PhoP and negatively regulated by RcsB. A second distal promoter, PiolE, is negatively regulated by the myo-inositol island repressor IolR, whereas it is expressed upon Salmonella colonization of plants. Importantly, we also found that inappropriate expression of srfJ leads to reduced proliferation inside macrophages whereas lack of srfJ expression increases survival and decreases activation of defense responses in plants. These observations suggest that SrfJ is a relevant factor in the interplay between Salmonella and host of different kingdoms. Transcriptomic carried out in human epithelial HeLa cells and murine RAW264.7 macrophages detected 16 genes that are significantly down-regulated and 12 genes that are significantly upregulated in response to the presence of SrfJ. Proteomic analysis revealed that SrfJ is involved in dephosphorylation of WNK1 and prevention of induction of HSP60. The last part of this thesis was focused on the development of a live Salmonella vaccine against Pseudomonas aeruginosa. As T3SS-mediated translocation can be used for efficient delivery of heterologous antigens to the cytosol of antigen-presenting cells, we tested the possibility of using Salmonella effectors SseJ, SrfJ, SlrP, SteA and SseK1, as carriers in the design of this vaccine. We finally developed a vaccine delivering the Pseudomonas antigen PcrV in fusion with SseJ through the T3SS. This vaccine protected mice against lethal infections with P. aeruginosa.

Salmonella enterica es una especie de bacterias patógenas que pueden producir diferentes enfermedades desde gastroenteritis a enfermedades sistémicas. Salmonella posee dos sistemas de secreción tipo III (T3SS) relacionados con la virulencia que son elementos clave en la interacción con la célula hospedadora. Estos sistemas median la translocación de proteínas efectoras al citosol de la célula hospedadora donde interfieren con diferentes procesos celulares para permitir la entrada del patógeno y su supervivencia dentro de vacuolas. Se estudió la expresión del efector SrfJ de S. enterica serovar Typhimurium. Se averiguó la existencia de dos promotores distintos que controlan la expresión de srfJ. Un promotor proximal, PsrfJ, que responde a las señales intravacuolares dentro de las células de mamífero y está regulado positivamente por SsrB y PhoP y negativamente por RcsB. Un segundo promotor distal, PiolE, que está regulado negativamente por el represor de la isla de utilización del mio-inositol, IolR, mientras que se expresa tras la colonización de plantas por Salmonella. A su vez, se estableció que la expresión inapropiada de srfJ conduce a una reducción de la proliferación en macrófagos, mientras que la falta de expresión de srfJ aumenta la supervivencia y disminuye la activación de las respuestas de defensa en plantas. Estas observaciones sugieren que SrfJ es un factor relevante en la interacción entre Salmonella y hospedadores de diferentes reinos. A través del análisis transcriptómico llevado a cabo en células epiteliales humanas HeLa y macrófagos de ratón RAW264.7 se detectaron 16 genes con expresión significativamente reducida y 12 genes con expresión significativamente aumentada en respuesta a la presencia de SrfJ. Un análisis proteómico indicó que SrfJ está implicado en la desfosforilación de WNK1 y en la prevención de la inducción de HSP60. La última parte de esta tesis se centró en el desarrollo de una vacuna viva de Salmonella contra Pseudomonas aeruginosa. Dado que la translocación mediada por T3SS puede usarse para la administración eficiente de antígenos heterólogos al citosol de células presentadoras de antígeno, se probó el uso de los efectores de Salmonella SseJ, SrfJ, SlrP, SteA y SseK1, como portadores en el diseño de la vacuna. Finalmente desarrollamos una vacuna en la que el antígeno PcrV de Pseudomonas en fusión con SseJ se secreta a través de un T3SS. Esta vacuna protegió a los ratones contra una infección letal con P. aeruginosa.