Caracterización funcional de dos efectores de los sistemas de secreción tipo III de salmonella y estudio de su impacto en el hospedador

Abstract

Numerosas bacterias patógenas Gram negativas poseen sistemas de secreción tipo III (SST3) relacionados con la virulencia que les permiten translocar proteínas, denominadas efectores, desde la bacteria hacia la célula hospedadora eucariótica. Salmonella enterica posee dos de esos sistemas, codificados en las islas de patogenicidad 1 y 2 (SPI-1 y SPI-2), respectivamente. Por medio de ellos, Salmonella secreta más de 30 efectores. Los efectores interfieren con determinados procesos celulares para permitir la entrada del patógeno y su supervivencia en vacuolas. En la primera parte de esta tesis se abordó el estudio del efector de S. enterica serovar Typhimurium SlrP, una ligasa de ubiquitina de la familia NEL. Como continuación de un trabajo anterior se resolvió la estructura tridimensional del complejo entre SlrP y su sustrato, la tiorredoxina humana Trx1. Las dos proteínas forman un complejo heterotetramérico en el que cada molécula de SlrP interacciona con las dos moléculas de Trx1. El modelo estructural permitió predecir las posibles dianas de ubiquitinación en Trx1 y experimentalmente se demostró que la Lys94 es una de ellas. El modelo también permitió proponer un mecanismo molecular para la liberación, en presencia del sustrato, de la autoinhibición de la actividad de SlrP. Se estudió también la expresión y la translocación de SlrP usando fusiones traduccionales lac, 3xFLAG y cyaA¿. Aunque slrP se expresó en diferentes medios, la máxima expresión se obtuvo en condiciones que imitan el ambiente intravacuolar. La translocación tuvo lugar por medio de los dos SST3 dependiendo del tipo celular hospedador y el tiempo de infección. La búsqueda de reguladores de slrP reveló que este gen está regulado por LeuO, Lon y el sistema de dos componentes PhoQ/PhoP. Nuestros experimentos sugieren que LeuO y Lon actúan a través de HilD en condiciones de inducción de la SPI-1, mientras que PhoP interacciona directamente con el promotor de slrP para activar la transcripción en condiciones de inducción de la SPI-2. En un análisis transcriptómico y proteómico de células HeLa transfectadas establemente con el gen del efector SlrP se encontró expresión diferencial de un total de 83 genes del hospedador. La última parte de la tesis se dedicó al estudio de los genes srf, como candidatos a codificar efectores del SST3 codificado en la SPI-2. Nuestros experimentos aportan pruebas de que SrfJ es un sustrato de este sistema. El gen srfJ está regulado positivamente por PhoP a través del sistema de dos componentes SsrA/SsrB y negativamente por IolR, el represor de los genes implicados en la utilización de mioinositol como fuente de carbono. La expresión de srfJ en levaduras produjo un fenotipo de letalidad que se suprimió con la sobreexpresión de los genes RPP2A y SFG1.