Nuevos derivados de quitosano funcionalizados en el grupo amino, de alto valor añadido

Abstract

La presente Tesis Doctoral es una contribución al avance de la química del quitosano como una vía de valorización y aprovechamiento de los residuos de cangrejo rojo Procambarus clarkii generados en las Marismas del Guadalquivir. Consta de cinco capítulos bien diferenciados, de los cuales los cuatro primeros tienen como objetivo común el desarrollo de nuevos derivados N-sustituidos de quitosano que por sus propiedades físico-químicas puedan tener aplicación práctica en distintos campos. La unidad activa que a través de una función puente determinada unimos al esqueleto polimérico es responsable o modula esas propiedades, en cada caso. El quinto capítulo explora aplicaciones bio- y tecnológicas concretas, en particular actividad antimicrobiana y capacidad para generar nanopartículas, films y geles, del propio quitosano y de algunos de sus nuevos derivados. En el primer capítulo, titulado “Nuevos derivados anfifílicos de quitosano con funcionalidad de amida y de 1,2-hidroxilamina” se describe la preparación de derivados fluorescentes conteniendo un puente de amida a partir de quitosanos de bajo peso molecular CS4 (Mw = 87875 g•mol-1, DD = 86%) o CS5 (Mw = 97600 g•mol-1, DD = 87%) y distintas cumarinas funcionalizadas (ácido 3-carboxicumarínico, ácido 7-hidroxicumarin-4-il-acético, ácido 7-dietilaminocumarin-3-il-carboxílico). El 7-hidroxicumarinil derivado de quitosano exhibió alta intensidad de emisión de fluorescencia a bajo grado de sustitución (DS 6.7%). Un sensor de cambios de pH, con interesantes propiedades UV y de fluorescencia, con detección exquisita entre pH 1.0 a 7.0, se preparó por reacción de quitosano ácido 7-dietilaminocumarin-3-il-carboxílico. Reacciones modelo entre clorhidrato de 1,3,4,6-tetra-O-acetil-2-amino-2-desoxi-β-D-glucopiranosa y los ácidos 3-carboxicumarínico y 7-hidroxicumarin-4-il-acético se realizaron previamente para optimizar las condiciones de reacción y facilitar el análisis por espectroscopía de los derivados de quitosano. También se sintetizó un derivado fluorescente quitosano-cumarina con funcionalidad puente de 1,2-hidroxilamina mediante apertura quimioselectiva del anillo de oxirano del (2,3-epoxipropoxi)cumarina por el grupo amino del quitosano y se estudió la regioselectividad del proceso por 2D 1H-1H COSY. El mismo tipo de funcionalidad puente existe en el nuevo derivado de quitosano que se obtuvo mediante apertura nucleofílica del (-)óxido de cariofileno por el grupo amino. Se ha demostrado la capacidad de este derivado y de algunos de los derivados cumarina-quitosano sintetizados para formas micelas en agua y calculado la concentración micelar crítica en cada caso. El DS de los distintos derivados de quitosano preparados se determinó por 1H RMN y osciló entre 6.7 y 42.0 %. Los Mn y Mw de los derivados estudiados mediante HPLC/SEC fueron mayores que los de los quitosanos de partida utilizados, lo que indica que los procesos de preparación empleados transcurren sin degradación de la cadena polimérica. El segundo capítulo bajo el título “Iminas y aminas secundarias derivadas de quitosano” describe, en primer lugar, la preparación de una variedad de los derivados de quitosano del título con propiedades fluorescentes y/o antimicrobianas bajo condiciones muy suaves por reacción, en supensión metanólica acidificada, del quitosano de bajo peso molecular CS5 (Mw 97600 g mol-1, DD = 87%) con aldehídos aromáticos (4-N,N-difenilaminobenzaldehído, bifenil-4-carboxaldehído, 4-nitrobenzaldehído, 4-hidroxibenzaldehído, 4-N,N-dimetilamino-1-naftaldehído, 1-pirencarboxaldehído). Se incluye un estudio sin precedentes para la evaluación del grado de N-sustitución (DS) utilizando 13C CPMAS RMN en las bases de Schiff derivadas de quitosano (DS comprendidos entre el 12.0 y el 31.7%), como es requerido por la conocida inestabilidad de la función imino en soluciones ácidas. Una correlación lineal entre los DS obtenidos para las aminas secundarias derivadas de quitosano mediante 1H RMN (10.2 a 55.3%) y los obtenidos por 13C CPMAS RMN (13.8 a 34.4%) nos ha permitido calcular un factor de correlación empírico que podría ser aplicado en otros sistemas aromáticos basados en quitosano. La reacción simultánea de varios aldehídos con quitosano fue exitosamente llevada a cabo y los resultados de DS de cada una de las unidades incorporadas fueron apoyados/justificados por estudios cinéticos. También se realizó, en colaboración con el Prof. C. Bliard del Institut de Chimie Moléculaire de Reims” CNRS-UMR (Francia), la aminación reductiva del quitosano CS4 con un polisacárido polimaltosídico altamente cristalino, como una forma de obtener una presentación multivalente de un polímero sobre el esqueleto de otro polímero. Algunos de los derivados sintetizados fueron fluorescentes. Los derivados de quitosano nuevos emiten fluorescencia con alta intensidad y estabilidad. Su uso como sensores de polaridad se exploró con la base de Schiff obtenida por reacción del quitosano con el bifenil-4-carboxaldehído, encontrándose que la adición de pequeñas cantidades de disolvente no polar como el diclorometano, provocaba drásticos cambios en la longitud de onda e intensidad de la emisión. Este comportamiento como sensor fluorescente de polaridad, unido a la quiralidad del esqueleto polimérico y a la posibilidad de modular el comportamiento fluorescente variando la naturaleza del aldehído de partida utilizado, permite esperar que estos nuevos polímeros tengan aplicación como sensores polivalentes en sistemas biológicos. Se determinó el Mw y Mn de las aminas secundarias derivadas de quitosano por HPLC/SEC. Los valores de pesos moleculares de los obtenidos para estos derivados respecto a los quitosanos de partida confirmaron que las condiciones de preparación utilizadas no degradan la cadena polimérica. En el tercer capítulo, relativo a “Ureas derivadas de quitosano” se prepararon dos tipos de derivados a partir de quitosano de bajo peso molecular CS4: ureidil derivados por reacción del biopolímero con isocianatos (fenilisocianato, 3,5-dimetilfenilisocianato y 4-bifenililisocianato) y derivados de quitosano entrecruzados a partir de quitosano y diisocianatos [4,4'-metilenbis(fenilisocianato), hexametil diisocianato)]. Previamente, para establecer las condiciones óptimas de reacción se llevaron a cabo las reacciones modelo correspondientes del clorhidrato de 1,3,4,6-tetra-O-acetil-2-amino-2-desoxi-β-D-glucopiranosa con los mismos isocianatos y diisocianatos. La ausencia de la banda del carbamato a 1700 cm-1 en FTIR, la información proporcionada por 1H RMN, 2D 1H-1H COSY, las condiciones de reacción, y la insolubilidad de los productos en disolventes orgánicos confirman la ausencia de O-sustitución en la reacción entre quitosano y los distintos isocianatos. Los DS de los derivados de quitosano preparados en este capítulo oscilan entre 5.8 y 29.2% (determinados por 1H RMN). El cuarto capítulo, “Formación de derivados de quitosano cuaternizados” describe en primer lugar la cuaternización de los quitosanos de bajo peso molecular CS3 (Mw = 86352 g mol-1, DD = 86%) y CS4 con cloruro de glicidiltrimetilamonio (GTMAC), en condiciones neutras en H2O para el quitosano CS4 y en condiciones ácidas a pH = 3.7 para el quitosano CS3. Estos derivados cuaternizados fueron solubles hasta pH 11 y 12 respectivamente. El estudio de la regioselectividad de la sustitución/apertura nucleófila se realizó con la ayuda de los espectros 1H RMN en tres distintos disolventes deuterados y de los espectros 2D 1H-1H COSY de los productos sintetizados en las distintas condiciones. Se obtuvo primordialmente para ambos tipos de condiciones de reacción el ataque del nucleófilo sobre el carbono menos sustituido del oxirano GTMAC. Con el fin de cuaternizar algunos de los nuestros nuevos derivados N-sustituídos de quitosano se siguieron dos estrategias diferentes. La primera, consistente en la cuaternización del derivado N-sustituido ya obtenido, se ensayó con éxito mediante la reacción de la urea obtenida a partir de quitosano y 3,5-dimetilfenil isocianato, con GTMAC. La segunda, utiliza un quitosano de partida cuaternizado de los descritos en el párrafo anterior, al cual se somete al proceso de N-sustitución deseado. Esta segunda estrategia se ensayó en la aminación reductiva entre el quitosano CS3 cuaternizado en condiciones ácidas y el 4-hidroxibenzaldehído, también con el resultado deseado. La solubilidad en medio ácido diluido de la urea cuaternizada aumentó con respecto a la urea de partida y la amina secundaria cuaternizada fue soluble en medio ácido, H2O y en medio básico hasta pH 12. Los DQ obtenidos para los distintos productos preparados en este capítulo están en el rango de 33.8 a 63.5 %. La realización de filtros de difusión en RMN nos ha permitido demostrar que la base de Schiff resultante de la reacción entre el quitosano CS3 cuaternizado y el 4-hidroxibenzaldehído no es estable en D2O. Dentro del capítulo 5 bajo el título “Aplicaciones” se describe, en primer lugar, la preparación de films a partir de distintas muestras de quitosano de peso molecular bajo y medio: CS1 (Mw = 42400 gmol-1, DD = 87 %), CS3 (Mw = 86352 gmol-1, DD = 86%) y CS6 (Mw = 160253 g mol-1, DD = 83%) por casting en microondas con ciclos de calentamiento y enfriamiento. La formación de films tiene lugar en 40 minutos, procedimiento mucho más rápido que otros métodos de secado descritos (48-72 horas). Además, se prepararon films de derivados de quitosano a partir de los films de quitosano previamente preparados como se ha indicado más arriba, mediante tratamiento de éstos con 4-nitrobenzaldehído, 4-hidroxibenzaldehído o bifenil-4-carboxaldehído. Se han caracterizado los films preparados por análisis de sus propiedades mecánicas y por FTIR. Algunos de los films obtenidos por irradiación con microondas son más resistentes (Módulo de Young = 3360-5129 MPa y TS = 45.5-61.7 MPa) que los hasta ahora descritos en la literatura a partir de quitosano y poseen mayor rigidez (%EB = 2.3-2.8). En un segundo apartado dentro de este capítulo se ha investigado la actividad antimicrobiana de algunos de los biomateriales basados en quitosano que hemos preparado frente a tres tipos de bacterias Gram-negativas: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, y Salmonella typhimurium, obtenidas de la Colección Española de Cultivos Tipos. Los ensayos microbiológicos sobre estas bacterias se realizaron en platos de agar con quitosano o aminas secundarias derivadas de quitosano en solución, films o como sólidos. El quitosano CS1 en disolución presentó alta capacidad de inhibición frente a S. typhimurium y E. coli y la amina secundaria derivada de quitosano resultante de la reacción del biopolímero con bifenil-4-carboxaldehido, en estado sólido presentó actividad antibacteriana sobre los tres tipos de bacterias analizados, mostrando en disolución altos valores del % de inhibición en todos los casos (100, 98.0 y 92.5, para S. typhimurium, E. coli y K. pneumoniae, respectivamente). En tercer lugar en este capítulo, durante una estancia realizada dentro del grupo del Prof. C. Bliard, se ha hecho un estudio comparativo de la preparación de nanopartículas de quitosano por el procedimiento de gelación iónica con tripolifosfato de sodio en 1 % CH3COOH y en tampón 0.1 M NH4OAc /0.2 M CH3COOH obteniéndose mayor cantidad de nanopartículas, con tamaños más homogéneos, y menor tamaño para la misma relación quitosano:TPP al utilizar el tampón 0.1 M NH4OAc /0.2 M CH3COOH, aunque con menor potencial zeta que las preparadas en 1 % CH3COOH. Además, se han preparado nanopartículas del derivado de la reacción entre quitosano CS5 y el ácido 7-hidroxicumarin-4-il-acético y entrecruzando con TPP en tampón 0.1 M NH4OAc /0.2 M CH3COOH. Las nanopartículas de menor tamaño fueron en este caso de 168 nm. Se correlacionó el tamaño de partícula con la emisión de fluorescencia, obteniéndose menor fluorescencia a menor tamaño. Por tanto, este derivado cumarínico origina no sólo micelas en agua, como ya se describió en el capítulo 1, sino también nanopartículas fluorescentes con la posibilidad de calcular el tamaño de las nanopartículas en base a su fluorescencia con una curva de calibración. Finalmente, se ha explorado el proceso de formación de geles híbridas orgánicas e inorgánicas basado en la reacción entre nanopartículas de siloxano y quitosanos de bajo peso molecular (CS1 y CS3). A través de diversos ensayos utilizando diferentes reactivos como nanopartículas preparadas a partir de 3-glicidiloxipropil trimetoxisilano y tetrametoxisilano (nanopartículas GT), nanopartículas preparadas a partir de 3-aminopropil trimetoxisilano y tetrametoxisilano (nanopartículas AT) y glutaraldehído, se han optimizado las condiciones para la formación de geles entre los quitosanos mencionados y partículas GT, lo que nos ha llevado a concluir que el proceso de gelificación en estos casos es claramente dependiente del pH y de la temperatura.

This PhD Thesis aims to contribute to the progress of chitosan chemistry as a way of valuing and profiting from wastes generated by the red crab Procambarus clarkii in the Guadalquivir’s Marshes. It comprises five well-differentiated chapters, in which the first four have the common objective of developing new N-substituted chitosan derivatives that could have practical applications in different fields because of their physical-chemical properties. The active unit that is bound to the polymeric backbone through a bridge function is responsible or modulates these properties, in each case. The fifth chapter explores concrete biotechnological applications, in particular the antimicrobial activity and the capacity of chitosan and some if its derivatives of generating nanoparticles, films, and gels. The first chapter, entitled “New amphiphilic chitosan derivatives with amide and 1,2 hydroxylamine functionality”, describes the preparation of fluorescent derivatives containing an amide bridge from low molecular weight chitosan CS4 (Mw = 87875 g mol-1, DD = 86%) or CS5 (Mw = 97600 g•mol-1, DD = 87%) and different functionalized coumarins (3-carboxycoumarinic acid, 7-hydroxycoumarin-4-il-acetic acid, 7-diethylaminocoumarin-3-il-carboxylic acid). The 7-hydroxycoumarinyl chitosan derivative exhibited high fluorescence emission intensity at low degree of substitution (6.7%). A pH sensor, with interesting UV and fluorescence properties, with an exquisite detection between pH 1.0-7.0, was prepared by the reaction of chitosan with 7-diethylaminocoumarin-3-yl-carboxylic acid. Model reactions between 1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-amino-2-desoxi-β-D-glucopyranose hydrochloride and the 3-carboxycoumarinic and 7-hydroxycoumarin-4-yl-acetic acid were carried out previously to optimize reaction conditions and facilitate analysis by spectroscopy of chitosan derivatives. It was also synthesized a fluorescent chitosan-coumarin derivative with a 1,2 hydroxylamine bridge functionality by a chemoselective opening of the oxyrane ring of (2,3-epoxipropoxi)coumarin by the amino group of chitosan and the regioselectivity of the process was studied with 2D 1H-1H COSY. The same type bridge functionality exists in the new chitosan derivative that was obtained by nucleophilic opening of (-)caryophyllene oxide by the amine group. This derivative and of some other synthesized coumarin-chitosan derivatives have the capability to form micelles in water and the critical micellar concentration was calculated in each case. DS of the new chitosan derivatives was determined in each case by 1H NMR and it oscillated between 6.7 and 42.0%. The Mn y Mw of the studied derivatives, that was obtained by HPLC/SEC were higher than the starting chitosan, which indicates that the preparation occurred without degradation of the polymeric chain. The second chapter under the “Imino and secondary amino chitosans” describes, in first place, the preparation of a variety of chitosan derivatives with fluorescent and/or antimicrobial properties under very mild conditions by reaction, in an acidified methanolic suspension, of low molecular weight chitosan CS5 (Mw 97600 g mol-1, DD = 87%) with aromatic aldehydes (4-N,N-diphenylaminobenzaldehyde, biphenyl-4-carboxaldehyde, 4-nitrobenzaldehyde, 4-hydroxybenzaldehyde, 4-N,N-dimethylamino-1-naphthaldehyde, 1-pyrenecarboxaldehyde). An unprecedented study on the evaluation of the degree of N-substitution (DS, ranging from 12.0% to 31.7% ) for the chitosan Schiff bases by using solid state 13C CPMAS NMR is performed. A linear correlation between the DS obtained for the secondary amino chitosans by 1H NMR (10.2-55.3%) and those obtained by CPMAS 13C NMR (13.8-34.4%) has allowed us to calculate an empirical correlation factor that could be applied on other chitosan-based aromatic systems. Simultaneous reactions of several aldehydes with chitosan were successfully carried out, and the obtained DS values of each unit incorporated were supported by kinetic studies. It was also carried out, in collaboration with the Prof. Bliard of the Institut de Chimie Moléculaire de Reims” CNRS-UMR (France), the reductive amination of chitosan with a highly crystalline polymaltosidic polysaccharide, as a way to have a multivalent presentation of a polymer over the backbone of other polymer. Some of the synthesized derivatives were fluorescent. The chitosan derivatives emit fluorescence with high intensity and stability. Their use as polarity sensor was explored for the Schiff base obtained by the reaction of chitosan with biphenyl-4-carboxaldehyde, finding that the addition of traces of non-polar solvent such as dichloromethane caused drastic changes in the wavelength and intensity of emission. This behavior as polarity fluorescent sensor, together with chirality of the polymeric backbone and the possibility of modulating the fluorescent behavior varying the nature of the starting aldehyde used, allows expecting that these new polymers have application as polyvalent sensors in biological systems. The Mw and Mn of the chitosan secondary amines were determined by HPLC/SEC. The obtained values of molecular weight for these derivatives with respect of the starting chitosan confirmed that the preparation conditions did not degrade the polymeric backbone. In the third chapter, related to “Chitosan ureidyl derivatives”, it was prepared two types of derivatives from low molecular weight chitosan CS4, ureidyl derivatives by reaction of the biopolymer with isocyanates (phenyl isocyanate, 3,5-dimethylphenyl isocyanate and 4-biphenylyl isocyanate) and crosslinked derivatives from chitosan and diisocyanates [4,4'-methylenbis(phenyl isocyanate), hexamethylene diisocyanate)]. Previously, to establish the optimal reaction conditions, the corresponding model reactions of 1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-amino-2-desoxi-β-D-glucopyranose hydrochloride were performed with the same isocyanates and diisocyanates. The absence of the carbamate band at 1700 cm-1 in FTIR, the information provided by 1H RMN, 2D 1H-1H COSY, the reaction conditions, and the insolubility of the products in organic solvents, confirmed the absence of O-substitution in the reaction of chitosan and the different isocyanates. The DS of chitosan derivatives prepared in this chapter range from 5.8 to 29.2% (determined by 1H NMR). In the forth chapter, “Formation of quaternized chitosan derivatives” it is described in first place the cuaternization of low molecular weight chitosans CS3 (Mw = 86352 g mol-1, DD = 86%) and CS4 with glycidyltrimethylammonium chloride (GTMAC), in neutral conditions in H2O for chitosan CS4 and in acidic conditions at pH = 3.7 for the chitosan CS3. These quaternized derivatives were soluble until pH 11 and 12 respectively. The regioselectivity study of the nucleophilic substitution was carried out with the aid of the 1H NMR spectra in three different deuterated solvents and the 2D 1H-1H COSY of the synthesized products in the different conditions. The mainly obtained product for both types of reaction conditions was the one resulting from the attack of the nucleophile at the less substituted carbon of the oxirane ring. Two different strategies were followed for the quaternization of some of our new chitosan N-substituted derivatives. The first consists of the quaternization of the already obtained N-substituted derivative by treatement with GTMAC; it was essayed successfully by reaction of the urea obtained from chitosan and 3,5-dimethylphenyl isocyanate. The second approach uses a starting quaternized chitosan that was described in the previous paragraph, which then undergoes the desired N-substitution. This second strategy was essayed in the reductive amination between quaternized chitosan CS3 in acidic conditions and 4-hydroxybenzaldehyde, with a successful result. The solubility of the quaternized urea increased with respect of the starting urea in diluted acid medium and the quaternized secondary amine was soluble in acid medium, H2O, and in basic solution until pH 12. The obtained DQ for the different products prepared in this chapter are in the range from 33.8 to 63.5%. The NMR diffusion-filtered experiments allowed us to demonstrate that the Schiff base resulting from the reaction between quaternized chitosan CS3 and 4-hydroxybenzalehyde is not stable in D2O. Within chapter 5, under the title “Aplications”, it is described, in first place, the preparation of films from the different low and medium molecular weight chitosan samples: CS1 (Mw = 42400 g mol-1, DD = 87 %), CS3 (Mw = 86352 g mol-1, DD = 86%) y CS6 (Mw = 160253 g mol-1, DD = 83%) by casting in microwaves with cycles of heating and cooling. The formation of films take place in 40 minutes, a procedure much faster than other described casting methods (48-72 hours). In addition, films of chitosan derivatives were obtained from chitosan previously prepared as it is mentioned above, and then by treatment of these films with 4-nitrobenzaldehyde, 4-hydroxibenzaldehyde or biphenyl-4-carboxaldehyde. The prepared films have been characterized by the analysis of their mechanical properties and by FTIR. Some of the films obtained by microwave irradiation are more resistant (Young Modulus = 3360-5129 MPa and TS = 45.5-61.7 MPa) than what has been so far described in literature for chitosan and have higher rigidity (%EB = 2.3-2.8). In a second subsection within this chapter Antimicrobial activity of some chitosan based biomaterials have been determined for three types of Gram-negative bacteria: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Salmonella typhimurium, obtained from the “Colección Española de Cultivos Tipos”. The microbiological assays against these bacteria were perfomed in agar plates with chitosan or chitosan secondary amine derivatives in solution, films or as a solid. Chitosan CS1 in solution had high inhibitory capacity against S. typhimurium and E. coli and the secondary amine resulting from the reaction of the biopolymer with biphenyl-4-carboxaldehyde, in solid state had antibacterial activity against all three types of analyzed bacteria, showing high values of % of inhibition in all cases (100, 98.0 y 92.5, for S. typhimurium, E. coli and K. pneumoniae, respectively). In a third section of this chapter it is described a comparative study on the preparation of chitosan nanoparticles by the procedure of ionic gelation with sodium tripolyphosphate in 1% CH3COOH and in a 0.1 M NH4OAc /0.2 M CH3COOH buffer. This study was done during an internship in the lab of Prof. C. Bliard. A higher amount of nanoparticles, with more homogeneous and smaller sizes for the same proportion chitosan:TPP was obtained using the 0.1 M NH4OAc /0.2 M CH3COOH buffer, although with lower zeta potential values than the ones prepared in 1 % CH3COOH. In addition, nanoparticles have been prepared from the reaction of chitosan CS5 and 7-hydroxicoumarin-4-yl-acetic acid and crosslinked with TPP in the 0.1 M NH4OAc /0.2 M CH3COOH buffer. The nanoparticles of smaller size were in average 168 nm. The nanoparticle size was correlated with the fluorescence emission, the smaller the nanoparticle the lower emission. In consequence, this coumarinic derivative originates no only micelles in water, as it was described in chapter 1, but also fluorescent nanoparticles with the possibility of calculating the size of nanoparticles based on their fluorescence with a calibration curve. Finally, the process of formation of hybrid gels has been explored, based on the reaction between siloxane nanoparticles and low molecular weight chitosans (CS1 and CS3). The conditions for the formation of gels beween the mentioned chitosans and GT nanoparticles have been optimized through several assays using different reagents such as nanoparticles prepared from 3-glicidyloxypropyl trimethoxysilane and tetramethoxysilane (GT nanoparticles), 3-aminopropyl trimethoxysilane and tetramethoxilane (AT nanoparticles) and glutaraldehyde. From these studies, we concluded that the gelification process is clearly dependent on pH and temperature