Study of Pol5 protein from Saccharomyces cerevisiae and its human ortholog MYBBP1A in ribosome biogenesis

Abstract

Los ribosomas son los orgánulos celulares que llevan a cabo el llamado proceso de traducción, en el cual las proteínas se sintetizan utilizando la información codificada en los RNA mensajeros (mRNAs). Los ribosomas están formados por dos subunidades ribosómicas, una grande, denominada 60S en eucariotas, y otra pequeña, denominada 40S en eucariotas, que a su vez están compuestas por proteínas ribosómicas y RNA ribosómicos (rRNAs). En esta Tesis, se ha utilizado el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae para estudiar el proceso de biogénesis de los ribosomas, ya que este proceso está altamente conservado a lo largo de la evolución. En S. cerevisiae, la síntesis de ribosomas comienza en el nucléolo, continúa a través del nucleoplasma y finaliza en el citoplasma, donde los ribosomas maduros llevan a cabo la traducción. Los rRNAs se sintetizan como precursores (pre-rRNAs) que deben ser procesados y sufrir varias modificaciones para producir los diferentes rRNAs maduros (25S, 5.8S y 5S, que forman parte de la subunidad ribosómica 60S, y 18S, que forma parte de la subunidad ribosómica 40S). A lo largo del proceso de maduración de los ribosomas, se ensamblan 79 proteínas ribosómicas (46 para formar la subunidad ribosómica 60S y 33 para formar la subunidad ribosómica 40S), y se requieren más de 300 de los denominados factores de actuación en trans o factores de ensamblaje ribosómico. Estos factores garantizan la velocidad, la direccionalidad y la precisión de la síntesis de los ribosomas, se asocian a las subunidades ribosómicas nacientes y se disocian de ellas siguiendo un orden jerárquico, y no están presentes en los ribosomas maduros. A pesar del gran número de factores de ensamblaje ribosómico identificados hasta la fecha, algunos siguen siendo desconocidos y muchos están poco caracterizados. En esta Tesis, hemos estudiado la proteína de levadura Pol5, la cual fue primero identificada como la quinta DNA polimerasa esencial, y después como miembro de un complejo implicado en los primeros pasos de la síntesis de ribosomas, el complejo UTP-A. En este trabajo, hemos demostrado que Pol5 es un factor de ensamblaje ribosómico esencial necesario para la síntesis de las subunidades ribosómicas 60S. En concreto, esta proteína es necesaria para el procesamiento del pre-rRNA 27SB, ya que las células desprovistas de Pol5 muestran una acumulación de este precursor y un déficit de subunidades ribosómicas 60S. Hemos identificado las proteínas ribosómicas uL23 y eL27A como supresores multicopia de distintas mutaciones de pérdida de función de Pol5, lo que sugiere que la función de Pol5 está relacionada con el correcto ensamblaje de estas proteínas ribosómicas en el dominio III del rRNA 25S. Por otro lado, también se ha descrito que Pol5 participa en la síntesis de las subunidades ribosómicas 40S. En relación con esto, en esta Tesis hemos estudiado la idea de que Pol5 sea una proteína modular en la que cada una de sus funciones podría asignarse a un dominio específico de la proteína. Además, nuestros resultados muestran que la trans-complementación de Pol5 es posible cuando la proteína completa se reconstituye a partir de dos fragmentos truncados distintos. MYBBP1A (Myb binding protein 1A) es el supuesto ortólogo mamífero de Pol5, y a pesar de toda la información sobre esta proteína como supresor de tumores y su relación con diferentes procesos celulares, su papel en la biogénesis de ribosomas ha sido poco caracterizado. En este trabajo, hemos estudiado el papel de MYBBP1A en este proceso utilizando la levadura S. cerevisiae como modelo. Nuestros resultados muestran que MYBBP1A se asocia con partículas pre-ribosómicas 60S cuando se expresa de manera heteróloga en levadura. Sin embargo, MYBBP1A es incapaz de complementar la ausencia de su ortólogo Pol5 en la levadura y, además, su expresión provoca un efecto dominante negativo en el crecimiento de la levadura asociado a un defecto específico en la síntesis de la subunidad ribosómica 60S.