Role of FACT and other chromatin-related factors in the origin of genetic instability

Abstract

El mantenimiento de la integridad del genoma es un requisito indispensable para garantizar el correcto funcionamiento de la célula, así como una transmisión fidedigna de la información genética a la descendencia. Las fuentes de daño genotóxico pueden ser exógenas o derivadas del propio metabolismo celular. Para prevenir la inestabilidad genética, que en humanos está asociada al envejecimiento, tumorigénesis y enfermedades genéticas, las células cuentan con mecanismos que evitan o resuelven amenazas que potencialmente comprometen la estabilidad del genoma. La transcripción es un proceso esencial para el funcionamiento celular, pero también puede ser una fuente de inestabilidad genética. Durante el proceso de transcripción, tienen lugar cambios topológicos en el ADN que lo hacen más susceptible de ser dañado. Además, pueden formarse unas estructuras conocidas como bucles R ( R loops ) que constan de un híbrido ADN ARN y una cadena sencilla de ADN desplazada. Aunque cumplen funciones fisiológicas, la aparición no programada de bucles R puede dar lugar a roturas en el ADN, ya sea por la exposición de una cadena sencilla de ADN, que es más vulnerable a los agentes genotóxicos, o por el bloqueo de la horquilla de replicación, que da lugar a roturas en el ADN derivadas del estrés replicativo. Debido a que el mal funcionamiento de factores implicados en la prevención o resolución de los bucles R ha sido relacionado con diversas patologías, la identificación de nuevos factores relacionados con su metabolismo es de interés para el avance de la Biomedicina. Con el objetivo de identificar nuevas proteínas esenciales implicadas en la prevención de inestabilidad genómica asociada a bucles R, desarrollamos en esta tesis un escrutinio genético de daño en el ADN en una colección de más de 1200 mutantes termosensibles en el organismo modelo S accharomyces cerevisiae . Para facilitar la búsqueda, utilizamos la expresión controlada de la enzima citidina deaminasa humana (AID), que exacerba los fenotipos de inestabilidad genética asociada a bucles R. Esta aproximación nos permitió identificar al remodelador de cromatina de la familia SWI/SNF Mot1 como un nuevo factor importante en la prevención de inestabilidad genética mediada por bucles R. El funcionamiento defectuoso de Mot1 había sido relacionado con defectos en la elongación de la transcripción, así como un aumento de la transcripción pervasiva, el cual se había sugerido que podía interferir con el proceso de replicación. En nuestro estudio, hemos descubierto que el mal funcionamiento de Mot1 da lugar a inestabilidad genómica dependiente de bucles R. Este fenotipo parece estar relacionado con su papel en elongación, ya que se observa únicamente en secuencias difíciles de transcribir. De manera interesante, la acumulación de bucles R en células deplecionadas de Mot1 ocurre fundamentalmente durante la fase S del ciclo celular, sugiriendo que se originan como consecuencia de conflictos entre la maquinaria de transcripción y la de replicación. De manera consistente, la ausencia de Mot1 da lugar a un retraso en la progresión de la fase S así como defectos en el avance de la horquilla de replicación. Aunque es necesario llevar a cabo una investigación más profunda para elucidar el mecanismo molecular por el cual la ausencia de Mot1 produce estos efectos, dado que los niveles de inestabilidad genética observados son suaves, es probable que Mot1 actúe en regiones genómicas concretas o bien mediando la actividad de proteínas efectoras. En la segunda parte de esta tesis, analizamos el efecto a escala genómica de la depleción de Spt16 en cuanto a la acumulación de bucles R y de roturas de doble cadena en el ADN. Spt16 es una de las dos subunidades del complejo FACT, una chaperona de histonas que actúa en los procesos de transcripción, replicación y reparación del ADN. Aunque ya se conocía que el mal funcionamiento de FACT daba lugar a un aumento de los niveles de bucles R, así como el papel de FACT en la resolución de conflictos transcripción replicación en levaduras y células humanas, algunas cuestiones como la relación a escala genómica entre los niveles de bucles R y el daño asociado no habían sido resueltas. En este estudio descubrimos que la acumulación de bucles R en células deplecionadas de Spt16 ocurría fundamentalmente en la fase S, sugiriendo que es su papel en el proceso de replicación el responsable de prevenir la formación de estas estructuras. Además, realizamos un estudio a escala genómica de la acumulación de bucles R y daño en el ADN en células control y deplecionadas de Spt16. Notablemente, encontramos una gran acumulación de Spt16 en zonas propensas a conflictos transcripción replicación, indicando su importancia en la resolución de estos encuentros. Consecuentemente, la ausencia de Spt16 incrementaba los niveles de roturas de doble cadena en estas zonas conflictivas. Para finalizar, comparamos los datos generados a escala genómica tras la depleción de Spt16 con los generados para otros factores implicados en el metabolismo de bucles R: Hpr1 y Sen1. Este análisis nos permitió descubrir que la acumulación de dichas estructuras ocurría en regiones concretas del genoma, sugiriendo que dichos factores cumplen funciones específicas en la prevención de conflictos transcripción replicación mediados por bucles R.