Estudio de la ubicuitilación del complejo MRN mediada por SCF(bTrCP/FBXW7): implicaciones biológicas

Abstract

El cisplatino, como otros fármacos basados en platino, se encuentra entre los compuestos más usados en las quimioterapias contra distintos tipos de cánceres. Entre sus múltiples efectos, el cisplatino se une al ADN generando una gran variedad de lesiones que provocan, en última instancia, la muerte celular. Algunas de estas lesiones, en concreto las roturas de doble cadena, pueden ser reparadas por recombinación homóloga o por unión de extremos no homólogos, provocando resistencias al fármaco. Uno de los principales intervinientes en la reparación de las roturas de doble cadena es el complejo MRN (MRE11, RAD50 y NBS1), esencial para la identificación de las roturas, el reclutamiento de diversos factores de señalización y el procesamiento, todo ello encaminado a la reparación de las mismas. El complejo MRN también interviene en otros procesos, como la reparación del ADN tras la formación de aductos o tras el colapso de horquillas de replicación. Dado su papel en el mantenimiento de la estabilidad del genoma, los defectos en los componentes del complejo MRN se han asociado con enfermedades como el cáncer. La ubicuitilación de proteínas es una modificación post-traduccional que desempeña importantes funciones en la célula: desde la degradación de proteínas vía proteasoma o lisosoma, hasta la modificación de la localización de proteínas concretas o participando en procesos de señalización. La ubicuitilación de las proteínas tiene un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis celular. Por ello, las alteraciones en la ubicuitilación de determinadas proteínas pueden contribuir a la transformación tumoral. En el proceso de ubicuitilación intervienen distintas enzimas, entre las que destaca la ligasa de ubicuitina, por ser la encargada del reconocimiento del sustrato. La ligasa de ubicuitina SCF está formada por una serie de subunidades entre las que se encuentran las proteínas F-box, cuyo papel es identificar a los sustratos específicos de esta ligasa. Dos de las proteínas F-box más destacadas de SCF son TrCP y FBXW7. Ambas son responsables de la ubicuitilación de una gran variedad de sustratos implicados en múltiples procesos celulares, y tanto estos como dichas proteínas F-box se han relacionado con diferentes aspectos de la transformación tumoral. En esta Tesis nos hemos centrado en el estudio del complejo MRN como potencial sustrato de SCF(TrCP/FBXW7). En el laboratorio se había realizado un estudio de las proteínas que interaccionaban con TrCP y FBXW7 mediante espectrometría de masas, y entre ellas estaban algunos de los componentes del complejo MRN. Ahora hemos podido confirmar que existe una asociación in vivo entre estas proteínas F-box y el complejo MRN en el núcleo de las células de mamífero. Además, tanto SCF(TrCP) como SCF(FBXW7) son capaces de ubicuitilar in vitro e in vivo ciertos componentes del complejo, por lo que este es sustratos de ambas ligasas de ubicuitina. La asociación entre TrCP y MRN ocurre a través de MRE11, que es la diana in vivo de esta proteína F-box, y está regulada por las quinasas p70S6K y GSK3. Esta última quinasa también interviene en la asociación de FBXW7 con el complejo MRN. Profundizando en el papel fisiológico de las asociaciones entre estas proteínas Fbox y el complejo MRN, pusimos de manifiesto que TrCP estimula la localización de los componentes del complejo en la cromatina, aunque se requieren más estudios para conocer la relevancia de estos resultados. Por su parte, la interacción entre FBXW7 y el complejo MRN induce la degradación del mismo por la vía de la autofagia/lisosoma. La ubicuitilación llevada a cabo por SCF(FBXW7) permite que el complejo MRN se asocie con los mediadores del flujo autofágico, p62 y LC3, en el núcleo de la célula para, posteriormente, trasladarse a los lisosomas, donde se llevará a cabo su degradación. Este proceso se potencia cuando la célula entra en apoptosis derivada del tratamiento con agentes genotóxicos. Por último, a raíz de los ensayos que realizamos estudiando el comportamiento del complejo MRN en respuesta a cisplatino, observamos en varias líneas celulares que el tratamiento con dosis subletales de cisplatino provocaba su entrada en senescencia. Sin embargo, en las líneas celulares equivalentes que sobreexpresaban TrCP se producía muerte celular, mostrando además unos niveles de p21 CIP1 inferiores a los de las correspondientes líneas silvestres. En la Tesis discutimos las implicaciones derivadas de todos estos resultados.