Insights into RNA-mediated genome instability by altering ALY expression and the use of new drugs

Abstract

Las células han desarrollado una serie de mecanismos que utilizan de forma coordinada para mantener la integridad del genoma y permitir una correcta transmisión del material genético a su descendencia. Sin embargo, deben hacer frente a una amplia gama de daños en el genoma generados por agentes genotóxicos tanto internos como externos, y que en algunos casos pueden provocar roturas en el ADN. Las roturas de cadena sencilla son las más comunes, pero las de doble cadena son más citotóxicas. Todo ello puede desencadenar inestabilidad genética que se manifiesta en forma de mutaciones o reordenamientos cromosómicos. Si bien es cierto que puede suponer un motor para la evolución, la inestabilidad genética es una patología celular asociada al envejecimiento prematuro, el cáncer y patologías neurológicas. La transcripción es un proceso celular que permite copiar la información requerida desde el ADN al ARN. Este proceso es esencial para la supervivencia celular pero puede comprometer la integridad del genoma. Ello se debe en parte a cambios topológicos en el ADN que lo pueden hacer más vulnerable. Puede suponer un obstáculo para la replicación y aumentar los conflictos transcripciónreplicación que pueden desembocar en roturas de ADN. Los bucles R son una de las causas más estudiadas de la inestabilidad genética asociada a transcripción. Estas estructuras se componen de un híbrido de ADN-ARN y una cadena simple de ADN desplazada. Estos bucles R aunque pueden tener funciones fisiológicas, también pueden suponer un riesgo para la estabilidad del genoma. Por ello las células poseen factores y mecanismos para prevenir y/o resolver estas estructuras, entre las que se encuentran proteínas del metabolismo del ARN. Recientemente, se ha descrito la presencia de bucles R en las roturas de ADN, aunque si tienen o no alguna función de reparación del ADN no se ha resulto aún. Dada la conexión entre la transcripción y el ARN con la inestabilidad genética y el cáncer, nos preguntamos si factores previamente relacionados con el metabolismo del ARN tendrían un impacto en inestabilidad genética e incluso en la respuesta al daño en el ADN. Además, dada la emergente importancia del contexto de la cromatina en la formación de híbridos que pueden desencadenar en inestabilidad genética y cáncer decidimos buscar nuevos compuestos que incrementaran el nivel de estos bucles. En esta tesis hemos mostrado la importancia de mantener un nivel adecuado de la proteína de unión al ARN ALY para prevenir que la formación de híbridos de ADN-ARN y así preservar la integridad del genoma. Las células con un reducido nivel de ALY obtenido mediante silenciamiento con siARN, así como las que sobreexpresan esta proteína, muestran un mayor nivel de híbridos y de daño en el ADN. Por otro lado, mostramos que la proteína ALY es reclutada específica y rápidamente al sitio de daño en el ADN inducido mediante experimentos de microirradiación. A pesar de que ALY es una proteína cuyas funciones principales son de metabolismo del ARN, su reclutamiento al sitio de daño en el ADN solo depende parcialmente de la presencia de ARN o híbridos ADN-AR. No obstante, dicha localización depende completamente de PARylación, que genera cadenas de poly (ADP-ribosa). Así, el silenciamiento y la sobreexpresión de ALY generan problemas en la señalización o la reparación del daño inducido por microirradiación, lo cual sugiere que la proteína ALY podría interferir en la respuesta al daño al ADN. En una segunda parte de este trabajo, hemos podido identificar nuevos compuestos cuyo tratamiento provoca la acumulación de híbridos ADN-ARN. Para ello hemos realizado un escrutinio de alto rendimiento con microscopía de fluorescencia con el anticuerpo S9.6, que reconoce híbridos de ADN-ARN, y una colección de inhibidores y activadores de enzimas relacionadas con procesos epigenéticos. Tras el escrutinio, titulación y validación de los candidatos obtenidos, se seleccionaron tres compuestos para identificar el daño en el ADN que producían. Finalmente, nos centramos en los inhibidores de quinasas cuyo uso además de una acumulación de híbridos ADN-ARN generó daños en el ADN. En este sentido, el silenciamiento del factor de transducción de señales y activador de la transcripción STAT3, diana de uno de los compuestos seleccionados, aumenta los híbridos ADN-ARN. Queda por determinar el mecanismo por el que se produce este fenotipo. Por último, cabe resaltar el posible potencial clínico de estos dos compuestos, tal y como reflejan ensayos de viabilidad de células deficientes en, FANCD2 y BRCA2, factores relacionados con inestabilidad genética.