Descripción y caracterización de la interacción física entre los complejos MCM y RNR en respuesta a daños en el ADN

Abstract

El complejo MCM junto con el factor Cdc45 y el complejo GINS forman la helicasa replicativa en eucariotas, cuya actividad es esencial para la viabilidad de la célula y una diana clave en la regulación de la replicación. Además de su papel en la apertura del ADN, MCM tiene otras funciones que no están relacionadas con su actividad helicasa, pero que son importantes para la correcta transmisión de la información genética durante la replicación, como son la actividad chaperona en el ensamblaje de histonas parentales asociado a la replicación o el establecimiento de cohesión entre las cromátidas hermanas. Además, el complejo MCM participa en la respuesta a daños en el ADN a través del checkpoint y otros mecanismos menos estudiados. En concreto, la interacción de MCM con las proteínas de recombinación homóloga Rad51 y Rad52 promueve la replicación en presencia de aductos en el ADN y el relleno de los fragmentos de ADN de cadena sencilla (ssDNA) generados durante la replicación a través de estos obstáculos. Para profundizar en el papel de MCM durante la respuesta a daños en el ADN, en esta tesis hemos realizado una búsqueda de interactores de MCM en presencia y ausencia del agente genotóxico metil-metano sulfonato (MMS), precipitando Mcm4 en su forma nativa y analizando las proteínas co-precipitadas mediante espectrometría de masas. El análisis estadístico reveló interactores relacionados con la ruta de síntesis de desoxirribonucleótidos (dNTPs), encontrándose tanto subunidades de la ribonucleótido reductasa (RNR) como reguladores de la misma. La RNR es la enzima encargada de catalizar el paso limitante en la biosíntesis de novo de los dNTPs, por lo que es un complejo esencial tanto para la replicación como para la respuesta a daños en el ADN. En consecuencia, los complejos MCM y RNR son las maquinarias responsables de producir los principales sustratos para la síntesis de ADN: la helicasa MCM abre la doble hélice para generar el ssDNA que sirve de molde, y la RNR controla la producción de dNTPs con los que se sintetiza el ADN. Por tanto, sus actividades deben estar coordinadas tanto durante la replicación como en respuesta a daños en el ADN. La caracterización de estas interacciones sugiere que MCM interacciona con la forma canónica de RNR, aunque la regulación de su dinámica a lo largo del ciclo es diferente a la de MCM y RNR. Además, la disrupción de la interacción entre MCM y Rnr1 en un mutante MCM4-VC no causa defectos aparentes en la replicación o en la transcripción de los genes RNR. Sin embargo, genera sensibilidad a MMS e hidroxiurea y defectos tanto en la activación del checkpoint como en la resolución de los focos de Rad52 inducidos por estos agentes genotóxicos. Este fenotipo de resolución de focos de Rad52 no está asociado a defectos en la actividad helicasa de MCM ya que también se observa durante la reparación de un DSB inducido en el locus MAT por la endonucleasa HO, proceso que no requiere de MCM. De hecho, el mutante MCM4-VC presenta una cinética silvestre de reparación del corte. Estos datos sugieren que la interacción MCM/RNR promueve la salida de Rad52 de los centros de reparación una vez que el daño ha sido reparado. En conjunto, nuestros resultados establecen por primera vez una conexión física y funcional entre los complejos MCM y RNR cuya relevancia en la integridad genética y, en consecuencia, en las enfermedades que de ésta se derivan, requerirá futuros estudios.