Identificación y análisis funcional del lnc-Nr6a1 y del mRNA Serpine1 como reguladores tempranos de la transición epitelio-mesénquima

Abstract

La transición epitelio-mesénquima (EMT) es un proceso por el que las células sufren un cambio fenotípico reversible, perdiendo las características epiteliales y adquiriendo atributos mesenquimales. Estos cambios implican una reprogramación molecular a nivel transcripcional y postranscripcional. Entre los diferentes tipos de moléculas afectadas a nivel transcripcional, se encuentran los lncRNAs. En esta tesis se describe la identificación y caracterización de un lncRNA de ratón, localizado en el gen Nr6a1, nombrado por ello lnc-Nr6a1. Este lncRNA presenta dos isoformas, lnc-Nr6a1-1 y lnc-Nr6a1-2, cuya expresión se induce de forma temprana tras el tratamiento con el factor de crecimiento transformante b (TGF-b), utilizado para activar la EMT. La isoforma lnc-Nr6a1- 1 se transcribe como forma poliadenilada o no poliadenilada, en este último caso generándose un precursor que contiene los miR-181a2/b2. Las células carentes del gen Lnc-Nr6a1, que incluye las dos isoformas del lnc-Nr6a1 y los miR-181a2/b2, presentan un defecto en adhesión y en el metabolismo glicolítico. El análisis del interactoma de la isoforma lnc-Nr6a1-1 mostró que interacciona con distintas proteínas que forman complejos funcionales, como son los desmosomas o un potencial complejo glicolítico, indicando que puede actuar como molécula scaffold o de andamiaje. El hecho de que el defecto observado en adhesión y en el metabolismo glicolítico en células carentes del gen Lnc-Nr6a1 revierta con la sobreexpresión de la isoforma lnc-Nr6a1-1 confirma su implicación en estos procesos. La sobreexpresión independiente de las dos isoformas del lnc-Nr6a1 provoca un aumento en la capacidad de migración de las células NMuMG. Además, teniendo en cuenta que el tratamiento con TGF-b induce las dos isoformas del lnc-Nr6a1 y los miR-181a2/b2, se realizó un CRISPR de activación (CRISPRa) en células NMuMG del gen Lnc-Nr6a1, transcribiéndose las dos isoformas del lnc-Nr6a1 y los miRNAs y se comprobó que estas células presentaban una mayor capacidad migratoria, más resistencia a anoikis y cambios en los marcadores de expresión indicadores de inducción de EMT. Dentro de los mecanismos postranscripcionales que regulan la EMT, nos hemos centrado en aquellos llevados a cabo por moléculas de RNA que funcionen como esponjas de miRNAs regulando tempranamente el proceso de EMT. Mediante inmunoprecitación de la proteína argonauta 2 (AGO2), se han determinado los RNAs que aumentan o disminuyen en el complejo RISC tras el tratamiento con TGF-b. El análisis reveló que uno de los RNAs más enriquecidos en este complejo es Serpine1. Su inducción transcripcional y el parejo enriquecimiento en los complejos RISC tras el tratamiento con TGF-b sugiere que este mRNA realiza una función como esponja de miRNAs. La sobreexpresión del mRNA Serpine1 aumenta la capacidad migratoria e invasiva de las células NMuMG, incrementa la resistencia a anoikis e induce la expresión de marcadores característicos de EMT, confirmando su potencial tumorigénico. Entre los cambios proteómicos causados por la sobreexpresión del mRNA Serpine1, hay que destacar el factor de splicing TRA2B. Gran parte de los cambios de expresión génica causados por la sobreexpresión del gen Tra2b coinciden con los causados por el mRNA Serpine1.