Tesis (Genética)

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Tomato chlorosis Virus: harnessing infectious Clones for reverse genetics and expression vector Development
(2024-09-30) García Merenciano, Ana Cristina; Navas Castillo, Jesús; Fiallo Olivé, Elvira; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
Tomato chlorosis virus (ToCV) is a rapidly spreading crinivirus, whose global distribution has increased significantly over the past two decades. This work focuses on studying the minor capsid protein (CPm) of ToCV and its role in transmission, employing Bemisia tabaci MED and Trialeurodes vaporariorum as insect vectors. We investigated the molecular basis underlying its distinct transmission patterns. Notably, ToCV stands out as one of two criniviruses known to be transmitted by whitefly species from both genera, Bemisia and Trialeurodes. Moreover, developed expression vectors for GFP and Ros1 proteins derived from the infectious clone of ToCV AT80/99, utilizing Nicotiana benthamiana plants via agroinoculation. Additionally, efforts were made to establish a controlled infection system for pepper plants by synthesizing the infectious clone of ToCV from the MM8 isolate, which naturally infects pepper plants. Given the lack of commercially available tomato varieties resistant or tolerant to ToCV, virus control heavily relies on measures against vectors. Therefore, it becomes imperative to develop molecular tools that enhance our understanding of viral proteins and their interactions with both hosts and vectors.
Human Prefoldin regulates gene Transcription through FACT-mediated chromatin Dynamics
(2024-07-08) Fontalva Ostio, Sara; Muñoz Centeno, María de la Cruz; Chávez de Diego, Sebastian; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
The primary function of prefoldin is well-established in the cytoplasm, where it serves as a cochaperone, favouring the co-translational folding of actin and tubulin monomers by transferring them to the ATP-dependent class II chaperonin CCT. The canonical form of prefoldin comprises six subunits known as PFDN1, 2, 3, 4, 5, and 6. This complex is ubiquitous across archaea and all eukaryotic organisms, and exhibits a highly conserved structure, consisting of two α and four β subunits. While prefoldin's role in the cytoplasm is widely recognized, it is also found in the nucleus, where it has been associated with transcription regulation and pre-mRNA splicing. However, the precise molecular mechanisms connecting human prefoldin to the control of gene expression remain elusive; prompting us to make it the aim of this doctoral thesis. To unravel these mechanisms, we followed different proteomic and genetic approaches. We employed mass spectrometry and genome wide sequencing techniques to identify prefoldin interactors in chromatin, and to delineate the changes that occur in chromatin under prefoldin perturbation conditions. We also analysed the composition of elongating RNA polymerase-associated factors to visualize how prefoldin contributes to the gene transcription. Our findings reveal that the whole prefoldin complex is indeed present in human chromatin, localizes to active genes, exhibiting a distribution pattern similar to RNA polymerase II, and locally influences the expression of these genes. We found that this chromatinic prefoldin interacts with the FACT complex, enhancing the presence of this H2A/H2B histone chaperone at transcriptionally active genes. Accordingly, we found that prefoldin was required for the optimal co-transcriptional dynamic of histones, and more specifically, allowing the removal of non-canonical H2A-H2B dimers. In agreement with FACT´s role in preserving chromatin integrity, we found that lack of prefoldin provoked abnormal accessibility to intragenic regions of transcribed genes and activation of repressed repetitive elements. Furthermore, we also found that prefoldin is required for the recruitment of the protein kinase CDK9 to active genes, the phosphorylation of elongating RNA polymerase II in the Ser2 residues of its CTD domain, and the subsequent association of pre-mRNA splicing and cleavage factors. These findings highlight the role of prefoldin in ensuring accurate gene expression, regulating chromatin dynamics and maintaining chromatin integrity. This is consistent with previous conclusion on the nuclear functions of canonical prefoldin in budding yeast, and underscores its significance for gene expression throughout evolution.
Study of Pol5 protein from Saccharomyces cerevisiae and its human ortholog MYBBP1A in ribosome biogenesis
(2024-04-10) Ramos Sáenz, Ana; Cruz Díaz, Jesús de la; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
Los ribosomas son los orgánulos celulares que llevan a cabo el llamado proceso de traducción, en el cual las proteínas se sintetizan utilizando la información codificada en los RNA mensajeros (mRNAs). Los ribosomas están formados por dos subunidades ribosómicas, una grande, denominada 60S en eucariotas, y otra pequeña, denominada 40S en eucariotas, que a su vez están compuestas por proteínas ribosómicas y RNA ribosómicos (rRNAs). En esta Tesis, se ha utilizado el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae para estudiar el proceso de biogénesis de los ribosomas, ya que este proceso está altamente conservado a lo largo de la evolución. En S. cerevisiae, la síntesis de ribosomas comienza en el nucléolo, continúa a través del nucleoplasma y finaliza en el citoplasma, donde los ribosomas maduros llevan a cabo la traducción. Los rRNAs se sintetizan como precursores (pre-rRNAs) que deben ser procesados y sufrir varias modificaciones para producir los diferentes rRNAs maduros (25S, 5.8S y 5S, que forman parte de la subunidad ribosómica 60S, y 18S, que forma parte de la subunidad ribosómica 40S). A lo largo del proceso de maduración de los ribosomas, se ensamblan 79 proteínas ribosómicas (46 para formar la subunidad ribosómica 60S y 33 para formar la subunidad ribosómica 40S), y se requieren más de 300 de los denominados factores de actuación en trans o factores de ensamblaje ribosómico. Estos factores garantizan la velocidad, la direccionalidad y la precisión de la síntesis de los ribosomas, se asocian a las subunidades ribosómicas nacientes y se disocian de ellas siguiendo un orden jerárquico, y no están presentes en los ribosomas maduros. A pesar del gran número de factores de ensamblaje ribosómico identificados hasta la fecha, algunos siguen siendo desconocidos y muchos están poco caracterizados. En esta Tesis, hemos estudiado la proteína de levadura Pol5, la cual fue primero identificada como la quinta DNA polimerasa esencial, y después como miembro de un complejo implicado en los primeros pasos de la síntesis de ribosomas, el complejo UTP-A. En este trabajo, hemos demostrado que Pol5 es un factor de ensamblaje ribosómico esencial necesario para la síntesis de las subunidades ribosómicas 60S. En concreto, esta proteína es necesaria para el procesamiento del pre-rRNA 27SB, ya que las células desprovistas de Pol5 muestran una acumulación de este precursor y un déficit de subunidades ribosómicas 60S. Hemos identificado las proteínas ribosómicas uL23 y eL27A como supresores multicopia de distintas mutaciones de pérdida de función de Pol5, lo que sugiere que la función de Pol5 está relacionada con el correcto ensamblaje de estas proteínas ribosómicas en el dominio III del rRNA 25S. Por otro lado, también se ha descrito que Pol5 participa en la síntesis de las subunidades ribosómicas 40S. En relación con esto, en esta Tesis hemos estudiado la idea de que Pol5 sea una proteína modular en la que cada una de sus funciones podría asignarse a un dominio específico de la proteína. Además, nuestros resultados muestran que la trans-complementación de Pol5 es posible cuando la proteína completa se reconstituye a partir de dos fragmentos truncados distintos. MYBBP1A (Myb binding protein 1A) es el supuesto ortólogo mamífero de Pol5, y a pesar de toda la información sobre esta proteína como supresor de tumores y su relación con diferentes procesos celulares, su papel en la biogénesis de ribosomas ha sido poco caracterizado. En este trabajo, hemos estudiado el papel de MYBBP1A en este proceso utilizando la levadura S. cerevisiae como modelo. Nuestros resultados muestran que MYBBP1A se asocia con partículas pre-ribosómicas 60S cuando se expresa de manera heteróloga en levadura. Sin embargo, MYBBP1A es incapaz de complementar la ausencia de su ortólogo Pol5 en la levadura y, además, su expresión provoca un efecto dominante negativo en el crecimiento de la levadura asociado a un defecto específico en la síntesis de la subunidad ribosómica 60S.
Role of regulatory proteins in carotenoid biosynthesis and metabolism in Fusarium fujikuroi
(2024-04-12) Marente Bernal, Julia Natividad; Ávalos Cordero, Francisco Javier; Limón Mirón, María del Carmen; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
La capacidad de los hongos filamentosos de adaptarse a cambios ambientales a cambios ambientales ha conducido al desarrollo de mecanismos sofisticados, como la producción de metabolitos secundarios que, a pesar de no ser esenciales para estos organismos, usualmente les supone una ventaja adaptativa. Dentro del género Fusarium, se encuentran diversas estirpes reconocidas como grandes patógenos de plantas, causando pérdidas económicas significativas a nivel global. Además de su virulencia y producción de micotoxinas, estos hongos producen metabolitos con interés industrial, como los carotenoides. F. fujikuroi produce un carotenoide particular llamado neurosporaxantina, que ha demostrado tener un gran poder antioxidante en estudios in vitro, y actividad provitamina A y buena absorción en ratones. Lo que le otorga un gran interés biotecnológico. Aunque la ruta bioquímica y los genes estructurales de esta producción están descritos, aspectos del mecanismo regulatorio aún permanecen sin resolver. Esta tesis contribuye principalmente a profundizar en la comprensión de reguladores involucrados en la síntesis de carotenoides y en el metabolismo secundario del hongo F. fujikuroi. Se esclarece el rol del complejo White-Collar en F. fujikuroi, confirmando su mecanismo de acción como un heterodímero en este hongo. Se profundiza en el estudio de la proteína CarS, previamente identificada en mutantes súper productores de carotenoides. La sobreexpresión de carS confirma su papel como represor de la síntesis de carotenoides, provocando una represión absoluta de los genes involucrados en la síntesis y de la propia producción de este metabolito. Además, la generación de perfiles metabólicos a partir de datos de GC-MS y HPLC contribuyó a comprender el impacto de CarS y la luz en el metaboloma de este hongo. Finalmente, se aborda el estudio de un gen que codifica un factor de transcripción, ubicado junto a los genes de la carotenogenesis en el genoma. Su deleción y sobreexpresión no tuvieron efecto sobre la carotenogénesis, y por el contrario, afectaron varios genes involucrados en el transporte y asimilación de compuestos nitrogenados, lo que sugiere una función reguladora en el metabolismo del nitrógeno.
Regulación y modificación de rutas biosintéticas de metabolitos con interés industrial en Fusarium fujikuroi
(2024-03-22) Borrego Serrano, Ismael; Limón Mirón, María del Carmen; Padilla Palma, Rita María; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
Los hongos filamentosos han sido utilizados como organismos modelos para el estudio de diferentes procesos biológicos como la regulación por la luz y el ritmo circadiano, el control de la esporulación o las interacciones patógeno-planta, entre otros. El interés de estos hongos radica en sus capacidades para producir una gran diversidad de metabolitos secundarios. En este sentido, Fusarium fujikuroi destaca por la riqueza de su metabolismo secundario. Este trabajo se ha centrado en potenciar la producción de metabolitos de interés industrial, como los carotenoides y las giberelinas, a través de la regulación y modificación del metabolismo secundario de F. fujikuroi. También se ha analizado la producción de estos metabolitos en un biorreactor de tanque agitado. Los datos muestran que la sobreexpresión del dominio catalítico de la HMG-CoA reductasa en F. fujikuroi provoca un aumento de la producción de giberelinas, aunque no afecta a la producción de carotenoides. El análisis de la producción de carotenoides y giberelinas del mutante carS-/OE:thmgR sugiere que la alteración del flujo metabólico de los precursores de los terpenoides afecta a la producción de estos. La optimización de los parámetros de fermentación para la producción de giberelinas en el biorreactor revela que la velocidad de agitación favorece la solubilidad del oxígeno disuelto durante la producción de giberelinas, logrando aumentar la producción en un 550% y reduciendo el tiempo de fermentación. Además, existe un correlación positiva entre la disminución del pH del cultivo y un aumento de la producción de giberelinas. Estos resultados muestran el potencial de escalada del bioproceso utilizando estirpes modificadas para la producción de giberelinas mediante la valorización de subproductos agroindustriales como medios de cultivo Por otra parte, los mutantes superproductoras en fondo mutante ?carX, obtenidos mediante mutagénesis con luz UV, acumulan hasta un 73% de ?-caroteno tras cultivarlos en medio optimizado en matraces. Además, la cantidad de carotenoides de estos mutantes es la mayor lograda en F. fujikuroi hasta el momento. El fenotipo superproductor es debido a una disminución de la expresión del gen carS, principal regulador negativo de la carotenogénesis en Fusarium. La secuenciación del genoma completo de los mutantes SG292 y SG313 ha mostrado polimorfismos y variaciones estructurales en genes que podrían ser reguladores de la síntesis de carotenoides en F. fujikuroi. Sin embargo, es necesario comprobar por mutación dirigida cuál de las variaciones encontradas es la causante del fenotipo superproductor. La producción de carotenoides del mutante carS- en el biorreactor ha permitido alcanzar la mayor producción de neurosporaxantina lograda hasta la fecha en Fusarium. Este estudio proporciona las bases para mejorar la producción de neurosporaxantina a escala industrial.
Role of FACT and other chromatin-related factors in the origin of genetic instability
(2024-02-15) Soler Oliva, María Eugenia; Aguilera López, Andrés; Gaillard, Hélène; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
El mantenimiento de la integridad del genoma es un requisito indispensable para garantizar el correcto funcionamiento de la célula, así como una transmisión fidedigna de la información genética a la descendencia. Las fuentes de daño genotóxico pueden ser exógenas o derivadas del propio metabolismo celular. Para prevenir la inestabilidad genética, que en humanos está asociada al envejecimiento, tumorigénesis y enfermedades genéticas, las células cuentan con mecanismos que evitan o resuelven amenazas que potencialmente comprometen la estabilidad del genoma. La transcripción es un proceso esencial para el funcionamiento celular, pero también puede ser una fuente de inestabilidad genética. Durante el proceso de transcripción, tienen lugar cambios topológicos en el ADN que lo hacen más susceptible de ser dañado. Además, pueden formarse unas estructuras conocidas como bucles R ( R loops ) que constan de un híbrido ADN ARN y una cadena sencilla de ADN desplazada. Aunque cumplen funciones fisiológicas, la aparición no programada de bucles R puede dar lugar a roturas en el ADN, ya sea por la exposición de una cadena sencilla de ADN, que es más vulnerable a los agentes genotóxicos, o por el bloqueo de la horquilla de replicación, que da lugar a roturas en el ADN derivadas del estrés replicativo. Debido a que el mal funcionamiento de factores implicados en la prevención o resolución de los bucles R ha sido relacionado con diversas patologías, la identificación de nuevos factores relacionados con su metabolismo es de interés para el avance de la Biomedicina. Con el objetivo de identificar nuevas proteínas esenciales implicadas en la prevención de inestabilidad genómica asociada a bucles R, desarrollamos en esta tesis un escrutinio genético de daño en el ADN en una colección de más de 1200 mutantes termosensibles en el organismo modelo S accharomyces cerevisiae . Para facilitar la búsqueda, utilizamos la expresión controlada de la enzima citidina deaminasa humana (AID), que exacerba los fenotipos de inestabilidad genética asociada a bucles R. Esta aproximación nos permitió identificar al remodelador de cromatina de la familia SWI/SNF Mot1 como un nuevo factor importante en la prevención de inestabilidad genética mediada por bucles R. El funcionamiento defectuoso de Mot1 había sido relacionado con defectos en la elongación de la transcripción, así como un aumento de la transcripción pervasiva, el cual se había sugerido que podía interferir con el proceso de replicación. En nuestro estudio, hemos descubierto que el mal funcionamiento de Mot1 da lugar a inestabilidad genómica dependiente de bucles R. Este fenotipo parece estar relacionado con su papel en elongación, ya que se observa únicamente en secuencias difíciles de transcribir. De manera interesante, la acumulación de bucles R en células deplecionadas de Mot1 ocurre fundamentalmente durante la fase S del ciclo celular, sugiriendo que se originan como consecuencia de conflictos entre la maquinaria de transcripción y la de replicación. De manera consistente, la ausencia de Mot1 da lugar a un retraso en la progresión de la fase S así como defectos en el avance de la horquilla de replicación. Aunque es necesario llevar a cabo una investigación más profunda para elucidar el mecanismo molecular por el cual la ausencia de Mot1 produce estos efectos, dado que los niveles de inestabilidad genética observados son suaves, es probable que Mot1 actúe en regiones genómicas concretas o bien mediando la actividad de proteínas efectoras. En la segunda parte de esta tesis, analizamos el efecto a escala genómica de la depleción de Spt16 en cuanto a la acumulación de bucles R y de roturas de doble cadena en el ADN. Spt16 es una de las dos subunidades del complejo FACT, una chaperona de histonas que actúa en los procesos de transcripción, replicación y reparación del ADN. Aunque ya se conocía que el mal funcionamiento de FACT daba lugar a un aumento de los niveles de bucles R, así como el papel de FACT en la resolución de conflictos transcripción replicación en levaduras y células humanas, algunas cuestiones como la relación a escala genómica entre los niveles de bucles R y el daño asociado no habían sido resueltas. En este estudio descubrimos que la acumulación de bucles R en células deplecionadas de Spt16 ocurría fundamentalmente en la fase S, sugiriendo que es su papel en el proceso de replicación el responsable de prevenir la formación de estas estructuras. Además, realizamos un estudio a escala genómica de la acumulación de bucles R y daño en el ADN en células control y deplecionadas de Spt16. Notablemente, encontramos una gran acumulación de Spt16 en zonas propensas a conflictos transcripción replicación, indicando su importancia en la resolución de estos encuentros. Consecuentemente, la ausencia de Spt16 incrementaba los niveles de roturas de doble cadena en estas zonas conflictivas. Para finalizar, comparamos los datos generados a escala genómica tras la depleción de Spt16 con los generados para otros factores implicados en el metabolismo de bucles R: Hpr1 y Sen1. Este análisis nos permitió descubrir que la acumulación de dichas estructuras ocurría en regiones concretas del genoma, sugiriendo que dichos factores cumplen funciones específicas en la prevención de conflictos transcripción replicación mediados por bucles R.
Molecular basis of Aicardi-Goutières syndrome
(2023-09-21) Moó Bajo, Andrea; Huertas Sánchez, Pablo; Jimeno González, Sonia; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
DNA is an essential molecule for the proper functioning of the cell that is constantly exposed to exogenous and endogenous damage. One of the most dangerous injuries in DNA are doublestrand breaks. There are two main pathways to repair the break. The choice between one pathway or another is highly regulated and a decisive step in this decision is a process known as resection of the break ends. This mechanism consists of DNA degradation around the break, leaving two 3' ends or tails of single-stranded DNA. This leads to the repair of the damage through homologous recombination, a pathway that is generally error-free. There are many diseases that are associated with problems in DNA repair. Recently, some of the genes which mutations are related to Aicardi-Goutières syndrome (AGS) have been associated with defects in the repair process. This is an inflammatory disease that typically develops during early stages of life and currently has no cure. Although some studies provide some information, the connection between this syndrome and DNA repair is still poorly understood. In this Thesis we have focused on verifying whether the different mutants associated with this disease (TREX1, SAMHD1, the RNase H2 complex, ADAR1, IFIH1 and LSM11) have a role in repair. We have confirmed that all of them present a defect on resection. After this, we have dedicated our efforts to find treatments that allow us to reverse this repair phenotype, with the prospect that they could also rescue the inflammatory-associated response observed in patients with this syndrome.
Genome Instability Associated with DNA Topoisomerase Activity during Gene Transcription
(2023-07-07) Rubio Contreras, Diana; Gómez Herreros, Fernando; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
Las lesiones que se producen en el ADN suponen un desafío continuo para la integridad genómica, siendo las roturas de doble cadena del ADN (DSBs) la lesión más citotóxica para la célula. Numerosos estudios han mostrado recientemente que una fuente fisiológica de DSBs es la actividad de las topoisomerasas de ADN, enzimas que eliminan el estrés torsional del ADN asociado a procesos relacionados con el metabolismo del ADN. Durante su actividad, las topoisomerasas inducen cortes transitorios en el ADN, pero estos cortes pueden volverse irreversibles y provocar DSBs generando inestabilidad genómica e incluso la muerte celular. Al comienzo de esta tesis, los mecanismos que permitían a las células eucariotas reparar estas DSBs eran prácticamente desconocidos. Esta es una pregunta importante ya que las DSBs asociadas a la transcripción son una fuente endógena importante de translocaciones cromosómicas, eventos clave en el origen y desarrollo de muchos tumores sólidos y leucemias. Adicionalmente, estas DSBs pueden constituir eventos clave en otros tipos de enfermedades como algunos síndromes neurodegenerativos. En esta tesis, hemos caracterizado el mecanismo molecular por el cual se forman y reparan las DSBs inducidas por las topoisomerasas de ADN 1 y 2 (TOP1 y TOP2) y sus consecuencias en la integridad genómica. Para ello, hemos estudiado la reparación de estas roturas inducidas por topoisomerasas en células quiescentes, así como su impacto en la inestabilidad genómica asociada a la transcripción. Además, también hemos diseñado un escrutinio genético en células quiescentes destinado a identificar factores implicados en la formación y en la reparación de estas DSBs inducidas por TOP1. Nuestros resultados han permitido aclarar las bases moleculares de la formación y la reparación de las DSBs originadas en el ADN por la actividad de TOP1 y TOP2 durante la transcripción, de manera independiente de la replicación. Es importante destacar que nuestros resultados tienen importantes implicaciones en los efectos secundarios de la quimioterapia basada en inhibidores de topoisomerasas, así como en las enfermedades neurodegenerativas asociadas a defectos en la reparación de roturas en el ADN.
Activity of the CarS RING finger protein and regulatory connections with CwhA and HmbC in Fusarium fujikuroi
(2023-07-25) Franco Losilla, Marta; Ávalos Cordero, Francisco Javier; Limón Mirón, María del Carmen; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
The genus Fusarium is a heterogeneous group of phytopathogenic fungi that causes diseases in a large diversity of economically important plants. In addition, Fusarium species produce a wide variety of secondary metabolites, several of which have been investigated in Fusarium fujikuroi. Our group investigates in this fungus the molecular mechanisms that regulate the synthesis of carotenoids, a class of lipophilic terpenoid responsible for the yellow, orange, or reddish pigmentation characteristic of many organisms. In F. fujikuroi carotenoid production is up-regulated by light through the photoreceptor WcoA, whereas a putative E3 ubiquitin ligase, the CarS RING Finger protein, is a down-regulator of the biosynthesis. Both regulatory proteins act modulating the mRNA levels of the genes of the carotenoid pathway (car genes). Loss of carS function results in carotenoid overproduction while its overexpression produces an albino phenotype. Previous assays in our group identified potential target proteins for CarS, one of them CwhA, ortholog of Cwh43 of Saccharomyces cerevisiae. Other strategies have been carried out to search for new potential regulators of the car genes, and recently two proteins of the HMG-box family were identified by a biotin-mediated pulldown method as able to bind to car genes promoters. In this Thesis, we investigated the mechanisms of action of the CarS protein and the regulatory connection with the CwhA and HmbC proteins, the latter one of the HMG-box proteins mentioned above. In chapter I, in vitro ubiquitination assays demonstrated the E3 ligase activity of CarS and the capacity of this protein to ubiquitinate purified WcoA in vitro, supporting regulatory connection between CarS and WcoA. Unfortunately, because of its very low amounts, CarS protein was not sufficiently detected in in F. fujikuroi extracts by western blot, which did not encourage to carry immunoprecipitation assays. In Chapter II, the biological role of CwhA was investigated through the study of targeted deletion mutants. The cwhA deletion revealed no significant effects except a lower germination rate of the conidia, suggesting a direct or indirect role of this protein in this process. However, the biological role of CwhA could be determined. The Cwh43 protein of S. cerevisiae is involved in the remodeling of GPI lipids to ceramides, and the expression of cwhA in a cwh43Δ yeast mutant restored this remodeling capacity, indicating the same enzymatic activity for CwhA. The cwhA mutant has minor lipidome alterations, but the mutation did not affect carotenoid biosynthesis in the wild type. However, the mutation doubled the carotenoid accumulation in a carS overproducing mutant, suggesting that the changes in the lipid content affects the ability of the mutant to store the excess of carotenoids. Finally, the function of HmbC protein from the High Mobility Group (HMG) family was also investigated in Chapter III by targeted deletion. The hmbC mutants increased carotenoid production due to higher mRNA levels of the car biosynthetic genes. Furthermore, hmbC deletion resulted in reduced carS mRNA levels, that could also explain the partial deregulation of the carotenoid pathway. Therefore, this protein is involved in the regulation of the carotenoid pathway, directly on the car genes, or indirectly through the control of the expression of gene carS. In both cases these regulatory actions are presumably carried out through an epigenetic mechanism related to chromatin structure, as reported for this class of proteins. The phenotype of the mutants indicates that HmbC participates also in other cellular processes. Thus, developmental alterations under specific stress conditions, or reduced sensitivity to cell wall degrading enzymes indicated by lower protoplast formation, suggest changes in cell wall chemical composition in the hmbC mutants. In summary, this Thesis contributes to elucidate the action mechanisms of the negative regulator of carotenogenesis CarS, and provides information on the function of two other proteins, one identified by its physical interaction with CarS, CwhA, involved in GPI lipids remodeling, and another one that participates in the regulation of carotenoid biosynthesis predictably by an epigenetic regulatory mechanism.
Unraveling the connection between centrosomes and the DNA damage response
(2023-06-20) Rodríguez Real, Guillermo; Huertas Sánchez, Pablo; Romero Balestra, Fernando; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
Centrosomes act as the major microtubule (MT) organizing centers (MTOC) in most animal cells. Structural or numerical defects in this organelle are associated with chromosome missegregation, polarity defects and motility or signaling alterations related to the absence of cilia or flagella, leading to several diseases like ciliopathies, brain disorders and cancer. In the last years, numerous publications have reported a possible role for the centrosome in the DNA damage response (DDR), with clear implications in cancer. However, it remains unclear if and how the centrosome itself plays a role specifically in the regulation of the DNA double strand breaks (DSBs) repair pathways. In this thesis we explore this aspect. Specifically, we show that centrosome presence in the cell is of utmost importance for homologous recombination (HR) and DNA end resection to take place properly. Plus, we uncover specific centrosomal factors involved in these processes. Among them, we state subdistal appendages (SDAs) components are relevant in DNA end resection and that this relies on CEP170 localization at this centrosomal structure. According to our results, CEP170 role in DNA end resection is produced from the centrosome likely by a signaling that involved its phosphorylation at Ser637 upon DNA damage induction. Finally, we suggest that some mediators such as BRCA1 and Centrin2 may be involved in CEP170 control over DNA end resection.
Molecular description of the role of protein synthesis in the cellular response to the treatment with the antitumoral drug Sorafenib in HCC lines
(2023-06-07) Contreras Bernal, Laura; Cruz Díaz, Jesús de la; Muntané Relat, Jordi; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
El carcinoma hepatocellular (CHC) es reconocido como el principal cáncer primario de hígado y uno de los cánceres con mayor incidencia y mortalidad a nivel mundial. Éste se desarrolla en un contexto de enfermedad hepática crónica donde la aparición, así como la progresión de la enfermedad, está influenciada por numerosos factores de riesgo. Desafortunadamente, el alto grado de heterogeneidad genética intratumoral dificulta el desarrollo de terapias verdaderamente eficaces. Sorafenib fue el primer fármaco aprobado por la FDA (Food and Drug Administration) para su uso como tratamiento en pacientes avanzados de CHC. A pesar de que otras terapias hayan sido recientemente aprobadas para su uso como primera línea de tratamiento en dichos pacientes, Sorafenib sigue siendo la opción recomendada para un porcentaje significativo de ellos. Este fármaco es un inhibidor multiquinasa con efectos anti-proliferativos, anti-angiogénicos y pro-apoptóticos. Desgraciadamente, Sorafenib cuenta con unos beneficios clínicos muy limitados ya que por un lado produce numerosos efectos secundarios y por otro, el desarrollo de resistencia al tratamiento es muy frecuente en esta enfermedad. Otras terapias basadas en diferentes inhibidores multiquinasa han sido estudiadas en ensayo clínico, pero desgraciadamente, han mostrado una eficacia inferior o igual al Sorafenib, sugiriendo que la efectividad clínica del fármaco podrías estar basada en efectos adicionales a su acción inhibidora de la actividad quinasa. El proceso de síntesis de proteínas, también conocido como traducción, consiste en la formación de nuevas cadenas polipeptídicas a partir de la información contenida en una molécula de RNA mensajero (mRNA). Dicho proceso es mediado por el ribosoma que, junto con numerosas proteínas llamadas factores de traducción, sintetizan las proteínas de novo en función de la demanda celular. El proceso de traducción constituye el principal punto de regulación de la expresión génica, donde los niveles del denominado complejo dependiente de cap, así como los niveles de fosforilación del factor de iniciación eIF2α (eIF2α) son los principales puntos de control. Adicionalmente, existen otros mecanismos de control menos frecuente que, junto con los anteriores, permiten a las células responder rápidamente a los cambios ambientales en un proceso conocido como reprogramación traduccional. La actividad aberrante del proceso de traducción está estrechamente vinculada a la transformación tumoral, así como a la resistencia celular a diversos tratamientos. De hecho, la hiperactivación de la actividad traduccional es considerada un sello del cáncer, donde la reprogramación traduccional contribuye a la alta plasticidad celular característica de las células tumorales. Sorafenib inhibe una de las principales vías de regulación de la síntesis de proteínas, la ruta de las MAPKs, la cual regula la actividad del complejo dependiente de cap. Asimismo, existen evidencias de un aumento de la fosforilación de eIF2α como consecuencia de la acumulación de proteínas mal plegadas en el retículo endoplásmico (ER) inducida por Sorafenib. Sin embargo, a pesar de las numerosas evidencias sobre la inhibición de la traducción por Sorafenib, y de los numerosos estudios que ponen en valor el proceso de síntesis de proteínas durante la transformación y progresión tumoral, el papel de la traducción en la respuesta celular al Sorafenib no ha sido estudiado con la suficiente profundidad. Esta tesis doctoral ha tenido como objetivo detallar el efecto de Sorafenib sobre la síntesis de proteínas, así como descifrar la relevancia biológica de este proceso entre las actividades tumorogénicas del fármaco. En primer lugar, nuestros resultados indican que Sorafenib afecta a la actividad de la maquinaria traduccional a distintos niveles: por un lado, afecta a la actividad del complejo dependiente de cap y por otro, induce la fosforilación de eIF2α. En segundo lugar, destacamos que la relevancia de cada mecanismo afectado difiere a lo largo del tiempo del tratamiento. Así pues, nuestros resultados muestran que, Sorafenib inicialmente altera la actividad del complejo dependientede cap, inhibiendo de forma específica la síntesis de un subconjunto de mRNAs y que, posteriormente, esta inhibición se extiende a un mayor rango de mRNAs tras la inducción de la fosforilación de eIF2α. Finalmente, parte de nuestras investigaciones estuvieron encaminadas a descifrar la reprogramación traduccional inducida por Sorafenib. Así pues, hemos realizado un mapa de traducción que muestra: (i) los mRNAs que se traducen en un contexto en el que la síntesis global de proteínas se encuentra inhibida; (ii) los procesos celulares en los que estos mRNAs están involucrados; y por último, (iii) los mecanismos que permiten su traducción. En conclusión, los resultados aquí presentados tratan de poner en relieve el papel de la síntesis proteica en la respuesta celular a Sorafenib. En primer lugar, basándonos en la inhibición selectiva de la traducción de mensajeros pro-tumorales como consecuencia de la desregulación de la actividad del complejo dependiente de cap, consideramos que la inhibición de la traducción posiblemente contribuye a los efectos anti-tumorogénicos del fármaco. Así pues, el uso de inhibidores de la maquinaria traduccional en combinación con Sorafenib podría resultar un enfoque terapéutico interesante para el tratamiento del CHC. En segundo lugar, proponemos que el estudio de la reprogramación traduccional inducida por Sorafenib podría abrir paso a nuevas líneas de investigación orientadas a predecir la respuesta al tratamiento, descifrar posibles mecanismos involucrados en la resistencia al fármaco y diseñar biomarcadores de pronóstico y de respuesta al tratamiento.
Non-canonical DNA structures in Double Strand Break repair
(2023-05-22) Camarillo Daza, María Rosa; Huertas Sánchez, Pablo; Jimeno González, Sonia; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
DNA double-strand breaks (DSBs) pose a serious threat to genome stability, so their proper repair is crucial for cell viability. To repair them, the cell has evolved two main alternative mechanisms, non-homologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). The correct choice between these two pathways is a key point to obtain a faithful restoration of the broken DNA sequence. One of best-known events regulating this decision is the generation of 3’ single-stranded DNA overhangs in a process known as DNA resection. Many different factors are involved in this process such as cell stemness, chromatin status or DNA conformation. In this Thesis, we investigated the role of G-quadruplexes, a noncanonical DNA structure, in DNA resection. First, we studied the impact of G-quadruplexes in this process and showed that DNA resection is impaired in the presence of these structures, both in vivo and in vitro. In addition, we demonstrated that PIF1α helicase activity unwinding G-quadruplexes promotes resection over these structures and that this process requires other factors such as BRCA1 and TOP2β. Furthermore, we took advantage of the key role of factors modulating DNA resection to regulate homologous recombination efficiency to search for new compounds that could affect CRISPR-Cas9 mediated homologous recombination efficiency.
eL15 and eL22 proteins and their functional environments during ribosome assembly in Saccharomyces cerevisiae
(2023-05-18) Fernández Fernández, José; Cruz Díaz, Jesús de la; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
Ribosomes are ribonucleoprotein complexes in charge of protein translation. Translation is an essential process in all organisms that involves decoding the information contained in mRNAs (messenger RNAs) to generate proteins. Similarly, the process of ribosome biogenesis represents a critical pathway for all cells. Ribosomes are comprised of two different subunits, one large and one small, also named 60S and 40S, respectively, in eukaryotes, among them Saccharomyces cerevisiae, which is the model organism employed in this thesis. As ribosome biogenesis is well conserved among different eukaryotes, S. cerevisiae is a perfectly appropriate organism for this study. Ribosomes of S. cerevisiae are composed of 79 ribosomal proteins and 4 ribosomal RNAs (rRNAs), three of them in the large (25S, 5.8S y 5S) and one in the small ribosomal subunit (18S). The biogenesis of ribosomes is an extraordinarily complex process, in which in addition of the four rRNAs and the 79-80 ribosomal proteins, take part about 100 small nucleolar RNAs (snoRNAs) and more than 300 assembly protein factors, which are not present in the mature subunits and therefore are also known as trans-acting factors. The synthesis of ribosomes is a sequential process highly regulated and organized that starts in the nucleolus and orderly progresses through the nucleoplasm; almost mature ribosomal particles are exported to the cytoplasm, where the last steps of maturation take place, previously to their involvement in the translation process. The role of the different components participating in the biogenesis of the ribosomal subunits has been broadly studied through last decades. However, there are numerous assembly factors and some ribosomal proteins which still await characterization. This was the case for the ribosomal proteins eL22 and eL15 during the assembly of the 60S ribosomal subunit before the study performed in this doctoral thesis. With respect to the eL22 ribosomal protein, in this thesis, we have observed that, although, in laboratory conditions, this protein is not essential for survival, cell growth and ribosome production are mildly affected in strains lacking eL22. In this context, we have proved that the synthesis of ribosomes lacking of eL22 is partially blocked in the nucleus. Thus, our results indicate that the presence of eL22 is necessary for the correct processing of the 27S pre-rRNAs. Moreover, we have observed that eL22 performs an important role in the cytoplasm, where its presence is likely needed for the efficient recycling of assembly factors Arx1 and Alb1. With respect to the eL15 ribosomal protein, in this thesis, we have shown that this protein is essential for the production of mature ribosomes and, thus, for the cell survival and cell growth. Specifically, we have demonstrated that eL15 is necessary for the precise processing of the 27SA3 and 27SB pre-rRNAs in the nucleolus. This is due to the role of eL15 in the stabilization of early ribosomal particles which permits the stable assembly of proteins of its own functional cluster (eL8, eL36 y eL13) and association of numerous assembly proteins, known as A3- and B-factors, which are necessary for the processing of the 27SA3 and 27SB pre-rRNAs, respectively.
Molecular bases of proliferative heterogeneity in Saccharomyces cerevisiae
(2023-05-11) Delgado Román, Irene; Chávez de Diego, Sebastián; Muñoz Centeno, María de la Cruz; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
Proliferative heterogeneity has been widely described in clonal cultures, but the mechanisms underlying this phenomenon are still poorly understood. On another hand, cell cycle regulation is tightly linked to proliferative capacity and previous transcriptomic studies revealed that yeast cells with less proliferative capacity display higher levels of the G1-S transition inhibitor Whi5. This regulator has been also linked to replicative aging in late steps of the mother cell lifespan. Considering this data, this thesis work has the following objectives: 1. To stablish a reliable method to study the influence of replicative age on proliferation heterogeneity. 2. Determining the role of Whi5 in proliferative heterogeneity. 3. Decipher the role of cell cycle regulation in coupling replicative age and proliferative heterogeneity In this work, we combined single cell microencapsulation with confocal microscopy to study heterogeneity in clonal cultures. Using this new method we found that a significant proportion of slow-growing microcolonies are founded by mother cells with a short number of division cycles. Using a Whi5 induble strain, we also found that this reduction in the proliferation capacity of microcolonies founded by young mother cells is related to the expression levels of Whi5. We can resume our results with the following conclusions: 1. Combination of cell microencapsulation and confocal microscopy is a reliable method to analyze cell lineages. 2. Replicative age substantially contributes to proliferative heterogeneity in clonal populations. 3. Decrease in proliferative capacity of young mother cells arises after the first mitotic division. 4. The progeny of a young mother cell can non-genetically inherit its decreased proliferative capacity. 5. The cell cycle regulator Whi5 participates in one of the mechanisms that links replicative age and cell proliferative capacity. Our results indicate that stably reduced proliferation is not exclusively linked to aged cells and open a new perspective to understand heterogeneity of clonal cell populations.
Insights into RNA-mediated genome instability by altering ALY expression and the use of new drugs
(2023-04-12) Guillén Mendoza, Cristina; Aguilera López, Andrés; Luna Varo, Rosa María; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
Las células han desarrollado una serie de mecanismos que utilizan de forma coordinada para mantener la integridad del genoma y permitir una correcta transmisión del material genético a su descendencia. Sin embargo, deben hacer frente a una amplia gama de daños en el genoma generados por agentes genotóxicos tanto internos como externos, y que en algunos casos pueden provocar roturas en el ADN. Las roturas de cadena sencilla son las más comunes, pero las de doble cadena son más citotóxicas. Todo ello puede desencadenar inestabilidad genética que se manifiesta en forma de mutaciones o reordenamientos cromosómicos. Si bien es cierto que puede suponer un motor para la evolución, la inestabilidad genética es una patología celular asociada al envejecimiento prematuro, el cáncer y patologías neurológicas. La transcripción es un proceso celular que permite copiar la información requerida desde el ADN al ARN. Este proceso es esencial para la supervivencia celular pero puede comprometer la integridad del genoma. Ello se debe en parte a cambios topológicos en el ADN que lo pueden hacer más vulnerable. Puede suponer un obstáculo para la replicación y aumentar los conflictos transcripciónreplicación que pueden desembocar en roturas de ADN. Los bucles R son una de las causas más estudiadas de la inestabilidad genética asociada a transcripción. Estas estructuras se componen de un híbrido de ADN-ARN y una cadena simple de ADN desplazada. Estos bucles R aunque pueden tener funciones fisiológicas, también pueden suponer un riesgo para la estabilidad del genoma. Por ello las células poseen factores y mecanismos para prevenir y/o resolver estas estructuras, entre las que se encuentran proteínas del metabolismo del ARN. Recientemente, se ha descrito la presencia de bucles R en las roturas de ADN, aunque si tienen o no alguna función de reparación del ADN no se ha resulto aún. Dada la conexión entre la transcripción y el ARN con la inestabilidad genética y el cáncer, nos preguntamos si factores previamente relacionados con el metabolismo del ARN tendrían un impacto en inestabilidad genética e incluso en la respuesta al daño en el ADN. Además, dada la emergente importancia del contexto de la cromatina en la formación de híbridos que pueden desencadenar en inestabilidad genética y cáncer decidimos buscar nuevos compuestos que incrementaran el nivel de estos bucles. En esta tesis hemos mostrado la importancia de mantener un nivel adecuado de la proteína de unión al ARN ALY para prevenir que la formación de híbridos de ADN-ARN y así preservar la integridad del genoma. Las células con un reducido nivel de ALY obtenido mediante silenciamiento con siARN, así como las que sobreexpresan esta proteína, muestran un mayor nivel de híbridos y de daño en el ADN. Por otro lado, mostramos que la proteína ALY es reclutada específica y rápidamente al sitio de daño en el ADN inducido mediante experimentos de microirradiación. A pesar de que ALY es una proteína cuyas funciones principales son de metabolismo del ARN, su reclutamiento al sitio de daño en el ADN solo depende parcialmente de la presencia de ARN o híbridos ADN-AR. No obstante, dicha localización depende completamente de PARylación, que genera cadenas de poly (ADP-ribosa). Así, el silenciamiento y la sobreexpresión de ALY generan problemas en la señalización o la reparación del daño inducido por microirradiación, lo cual sugiere que la proteína ALY podría interferir en la respuesta al daño al ADN. En una segunda parte de este trabajo, hemos podido identificar nuevos compuestos cuyo tratamiento provoca la acumulación de híbridos ADN-ARN. Para ello hemos realizado un escrutinio de alto rendimiento con microscopía de fluorescencia con el anticuerpo S9.6, que reconoce híbridos de ADN-ARN, y una colección de inhibidores y activadores de enzimas relacionadas con procesos epigenéticos. Tras el escrutinio, titulación y validación de los candidatos obtenidos, se seleccionaron tres compuestos para identificar el daño en el ADN que producían. Finalmente, nos centramos en los inhibidores de quinasas cuyo uso además de una acumulación de híbridos ADN-ARN generó daños en el ADN. En este sentido, el silenciamiento del factor de transducción de señales y activador de la transcripción STAT3, diana de uno de los compuestos seleccionados, aumenta los híbridos ADN-ARN. Queda por determinar el mecanismo por el que se produce este fenotipo. Por último, cabe resaltar el posible potencial clínico de estos dos compuestos, tal y como reflejan ensayos de viabilidad de células deficientes en, FANCD2 y BRCA2, factores relacionados con inestabilidad genética.
Transcriptional regulation by the Velvet complex during development in Neurospora crassa
(2023-04-21) Cea Sánchez, Sara; Corrochano Peláez, Luis María; Cánovas López, David; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
Developmental transitions in fungi are key to their success in colonizing new habitats and adapting to stressful environmental conditions. Developmental transitions are regulated by environmental factors such as light. Neurospora crassa is an ascomycete heterothallic filamentous fungus and a model organism for research on several aspects of fungal biology, including the study of light sensing and morphogenesis during development. The life cycle of N. crassa includes asexual development with the formation of vegetative conidia that are easily dispersed, and sexual development, a complex process involving the formation of sexual reproductive structures (perithecia), were the ascospores (meiotic products) are formed. The velvet complex is a fungal-specific protein complex that participates in the regulation of gene expression in response to environmental signals such as light, as well as developmental processes, pathogenesis, and secondary metabolism. In this thesis, we have characterized the role of the velvet complex (the velvet proteins VE-1 and VE-2, and the methyltransferase LAE-1) during different stages of the life cycle of N. crassa. We first started studying the role of this complex during asexual development. Mutations in ve-1 or ve-2, but not in lae-1 led to shorter height of aerial tissue and an increased development of macroconidia. Additionally, when ve-1 or ve-2 mutations were combined with mutations in the transcription factor gene fl, which is an activator of macroconidiation, lead to increased microconidiation. VE-2 and LAE-1 were detected during vegetative growth and conidiation, unlike VE-1 which was mostly observed in samples obtained from submerged vegetative hyphae. We propose that VE-1 is the limiting component of the velvet complex during conidiation and has a major role in the transcriptional regulation of conidiation. Characterization of the role of VE-1 by RNA seq experiments during mycelial growth and asexual development (conidiation) allowed the identification of a set of genes regulated by VE-1, most notably the transcription factor genes vib-1 and fl, that participate in the regulation of conidiation. We propose that VE- 1 and VE-2 regulate the development of aerial tissue and the balance between macro- and microconidiation in coordination with FL and VIB-1. During sexual development, strains lacking VE-1 and/ or VE-2 display a markedly delayed and reduced sexual development with fewer fruiting bodies compared to the wildtype strain. Alterations in the development of female structures, protoperithecia, in the ve-1 and ve-2 mutants suggested that the VE-1/VE-2 complex should regulate transcription during sexual development. We have characterized the transcriptome of wild-type and Dve-1 mutant strains over the time course of sexual development in both dark and light. Among the misregulated genes, we detected genes that are essential for sexual development, such as mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways, cell-cell fusion genes (ham genes) and transcription factor genes. Electrophoretic mobility shift essays of the promoter regions of the four MAPK genes suggest that VE-1 could be regulating sexual development by binding directly to promoters of these key regulatory genes. Furthermore, we detected transcription of ve-1, ve-2, and lae-1 during all stages of sexual development, but the three proteins were not detected in the later stages of development (4 and 6 days after fertilization), suggesting a major role for the velvet complex in the early stages of sexual development. Our results provide key insights into the control of multistage development processes by the regulatory velvet complex in the fungus N. crassa, and will help to understand how environmental signals are integrated in the fungal cell to regulate development.
Contribución de la ruta de reparación del ADN Anemia de Fanconi al mantenimiento de la estabilidad de la horquilla de replicación durante la incorporación de desoxirribonucleótidos hidroximetilados
(2023-02-16) Moreno Gordillo, Paula; Valle Rosado, Iván; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
El genoma está constantemente expuesto a agentes tanto endógenos como exógenos que amenazan la integridad del mismo. Es por ello por lo que las células han desarrollado diversos mecanismos para mantener la integridad de la información genética. Una de las rutas implicadas en mantener la integridad del genoma es la ruta de Anemia de Fanconi, sobre la cual se desarrolla el proyecto de esta tesis doctoral. La ruta de Anemia de Fanconi es la principal responsable de reparar la unión covalente entre las dos hebras del ADN, y la mutación que causa la no funcionalidad de la ruta tiene como consecuencia el desarrollo de la enfermedad de Anemia de Fanconi. Se trata de una enfermedad rara autosómica hereditaria, cuyos pacientes debutan a una edad temprana con fallo medular y desarrollo de tumores sólidos, entre otros. Sin embargo, la ruta de Anemia de Fanconi posee otras funciones también esenciales en el mantenimiento de la integridad del genoma, como es el mantenimiento de la estabilidad de las horquillas de replicación. En esta tesis se demuestra que la exposición de las líneas celulares de ratón deficientes para FANCD2 son sensibles a la exposición a ciertos análogos de la citosina, tales como 5-hidroximetilcitosina (5hmC) y 5-hidroximetiluracilo (5hmU), y que además dicha exposición causa un aumento de la inestabilidad genómica, el cual no se producía en la línea celular silvestre. Los datos muestran que la exposición a los análogos en ausencia de FANCD2 provoca la incorporación de ambos análogos, y dicha incorporación causa un bloqueo de la progresión de las horquillas de replicación y un aumento de la resección del ADN naciente. Además, la incorporación aumenta los marcadores de daño en el genoma tales como γH2AX, ADP-ribosilación y Rloops (S9.6), y provoca un aumento de los intercambios de cromátidas hermanas, indicando así la activación de la ruta de recombinación. Por último, en este estudio se demuestra que la incorporación de los análogos provoca un aumento de la presencia de PARP1 en cromatina y, que en ausencia de FANCD2, podría tener como consecuencia la desestabilización de las horquillas de replicación y por tanto, la muerte celular.
Descripción y caracterización de la interacción física entre los complejos MCM y RNR en respuesta a daños en el ADN
(2022-05-24) Yáñez Vilches, Aurora; Prado Velasco, José Félix; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
El complejo MCM junto con el factor Cdc45 y el complejo GINS forman la helicasa replicativa en eucariotas, cuya actividad es esencial para la viabilidad de la célula y una diana clave en la regulación de la replicación. Además de su papel en la apertura del ADN, MCM tiene otras funciones que no están relacionadas con su actividad helicasa, pero que son importantes para la correcta transmisión de la información genética durante la replicación, como son la actividad chaperona en el ensamblaje de histonas parentales asociado a la replicación o el establecimiento de cohesión entre las cromátidas hermanas. Además, el complejo MCM participa en la respuesta a daños en el ADN a través del checkpoint y otros mecanismos menos estudiados. En concreto, la interacción de MCM con las proteínas de recombinación homóloga Rad51 y Rad52 promueve la replicación en presencia de aductos en el ADN y el relleno de los fragmentos de ADN de cadena sencilla (ssDNA) generados durante la replicación a través de estos obstáculos. Para profundizar en el papel de MCM durante la respuesta a daños en el ADN, en esta tesis hemos realizado una búsqueda de interactores de MCM en presencia y ausencia del agente genotóxico metil-metano sulfonato (MMS), precipitando Mcm4 en su forma nativa y analizando las proteínas co-precipitadas mediante espectrometría de masas. El análisis estadístico reveló interactores relacionados con la ruta de síntesis de desoxirribonucleótidos (dNTPs), encontrándose tanto subunidades de la ribonucleótido reductasa (RNR) como reguladores de la misma. La RNR es la enzima encargada de catalizar el paso limitante en la biosíntesis de novo de los dNTPs, por lo que es un complejo esencial tanto para la replicación como para la respuesta a daños en el ADN. En consecuencia, los complejos MCM y RNR son las maquinarias responsables de producir los principales sustratos para la síntesis de ADN: la helicasa MCM abre la doble hélice para generar el ssDNA que sirve de molde, y la RNR controla la producción de dNTPs con los que se sintetiza el ADN. Por tanto, sus actividades deben estar coordinadas tanto durante la replicación como en respuesta a daños en el ADN. La caracterización de estas interacciones sugiere que MCM interacciona con la forma canónica de RNR, aunque la regulación de su dinámica a lo largo del ciclo es diferente a la de MCM y RNR. Además, la disrupción de la interacción entre MCM y Rnr1 en un mutante MCM4-VC no causa defectos aparentes en la replicación o en la transcripción de los genes RNR. Sin embargo, genera sensibilidad a MMS e hidroxiurea y defectos tanto en la activación del checkpoint como en la resolución de los focos de Rad52 inducidos por estos agentes genotóxicos. Este fenotipo de resolución de focos de Rad52 no está asociado a defectos en la actividad helicasa de MCM ya que también se observa durante la reparación de un DSB inducido en el locus MAT por la endonucleasa HO, proceso que no requiere de MCM. De hecho, el mutante MCM4-VC presenta una cinética silvestre de reparación del corte. Estos datos sugieren que la interacción MCM/RNR promueve la salida de Rad52 de los centros de reparación una vez que el daño ha sido reparado. En conjunto, nuestros resultados establecen por primera vez una conexión física y funcional entre los complejos MCM y RNR cuya relevancia en la integridad genética y, en consecuencia, en las enfermedades que de ésta se derivan, requerirá futuros estudios.
Identificación y análisis funcional del lnc-Nr6a1 y del mRNA Serpine1 como reguladores tempranos de la transición epitelio-mesénquima
(2022-05-12) Polo Generelo, Salvador; Pintor Toro, José Antonio; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
La transición epitelio-mesénquima (EMT) es un proceso por el que las células sufren un cambio fenotípico reversible, perdiendo las características epiteliales y adquiriendo atributos mesenquimales. Estos cambios implican una reprogramación molecular a nivel transcripcional y postranscripcional. Entre los diferentes tipos de moléculas afectadas a nivel transcripcional, se encuentran los lncRNAs. En esta tesis se describe la identificación y caracterización de un lncRNA de ratón, localizado en el gen Nr6a1, nombrado por ello lnc-Nr6a1. Este lncRNA presenta dos isoformas, lnc-Nr6a1-1 y lnc-Nr6a1-2, cuya expresión se induce de forma temprana tras el tratamiento con el factor de crecimiento transformante b (TGF-b), utilizado para activar la EMT. La isoforma lnc-Nr6a1- 1 se transcribe como forma poliadenilada o no poliadenilada, en este último caso generándose un precursor que contiene los miR-181a2/b2. Las células carentes del gen Lnc-Nr6a1, que incluye las dos isoformas del lnc-Nr6a1 y los miR-181a2/b2, presentan un defecto en adhesión y en el metabolismo glicolítico. El análisis del interactoma de la isoforma lnc-Nr6a1-1 mostró que interacciona con distintas proteínas que forman complejos funcionales, como son los desmosomas o un potencial complejo glicolítico, indicando que puede actuar como molécula scaffold o de andamiaje. El hecho de que el defecto observado en adhesión y en el metabolismo glicolítico en células carentes del gen Lnc-Nr6a1 revierta con la sobreexpresión de la isoforma lnc-Nr6a1-1 confirma su implicación en estos procesos. La sobreexpresión independiente de las dos isoformas del lnc-Nr6a1 provoca un aumento en la capacidad de migración de las células NMuMG. Además, teniendo en cuenta que el tratamiento con TGF-b induce las dos isoformas del lnc-Nr6a1 y los miR-181a2/b2, se realizó un CRISPR de activación (CRISPRa) en células NMuMG del gen Lnc-Nr6a1, transcribiéndose las dos isoformas del lnc-Nr6a1 y los miRNAs y se comprobó que estas células presentaban una mayor capacidad migratoria, más resistencia a anoikis y cambios en los marcadores de expresión indicadores de inducción de EMT. Dentro de los mecanismos postranscripcionales que regulan la EMT, nos hemos centrado en aquellos llevados a cabo por moléculas de RNA que funcionen como esponjas de miRNAs regulando tempranamente el proceso de EMT. Mediante inmunoprecitación de la proteína argonauta 2 (AGO2), se han determinado los RNAs que aumentan o disminuyen en el complejo RISC tras el tratamiento con TGF-b. El análisis reveló que uno de los RNAs más enriquecidos en este complejo es Serpine1. Su inducción transcripcional y el parejo enriquecimiento en los complejos RISC tras el tratamiento con TGF-b sugiere que este mRNA realiza una función como esponja de miRNAs. La sobreexpresión del mRNA Serpine1 aumenta la capacidad migratoria e invasiva de las células NMuMG, incrementa la resistencia a anoikis e induce la expresión de marcadores característicos de EMT, confirmando su potencial tumorigénico. Entre los cambios proteómicos causados por la sobreexpresión del mRNA Serpine1, hay que destacar el factor de splicing TRA2B. Gran parte de los cambios de expresión génica causados por la sobreexpresión del gen Tra2b coinciden con los causados por el mRNA Serpine1.
Global Dynamics of Topoisomerase II Activity
(2022-04-22) Terrón Bautista, José; Aguilera López, Andrés; Cortés Ledesma, Felipe; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética
DNA topoisomerases are key enzymes in charge of solving topological problems that arise from essential processes of DNA metabolism, such as transcription or replication. In transcription, topoisomerases have generally been considered facilitators of the advance of RNA polymerases; however, novel specific functions in transcriptional regulation are beginning to emerge. Furthermore, in recent years, type II topoisomerases (TOP2) have been related to genome architectural proteins, suggesting a role of these enzymes in the 3D organization of complex eukaryotic genomes. To systematically study the role of TOP2 activity in these contexts, we have developed ICEseq for the specific mapping of topoisomerase activity genome-wide. We have demonstrated that ICEseq is a robust and flexible method to specifically map topoisomerase activity. By using ICEseq information, we show that TOP2B and TOP2A activity is tightly associated with the transcriptional machinery. Furthermore, we demonstrate that transcription initiation, and not RNA POLII elongation, is a major source of the activity of both paralogs, not only at transcribed regions but also at distant places where transcription-associated supercoiling can diffuse to. Taking advantage of ICEseq, we have also studied topoisomerase activity during the transcriptional process using estrogen-induced transcription as a model. We find that TOP2A and TOP2B paralogs play opposite roles in estrogen signaling. We demonstrate that TOP2B suppresses transcription at ER-responsive genes and enhancers, and that downregulation of its activity by noncatalytic functions of TOP2A and ERα is required to aid long-range chromatin contacts, and thus facilitate gene expression. In contrast, the TOP2A paralog sustains transcription of estrogen-responsive genes. We therefore uncover a new layer in hormone-mediated transcriptional control that involves a close interplay between TOP2 activities, the regulation of transcription-induced DNA supercoiling, and the remodeling of 3D chromatin architecture to rapidly induce gene expression.

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