Preparación de nanosistemas por autoensamblaje de ciclodextrinas y calixarenos. Aplicaciones al transporte y a la liberación controlada de genes y fármacos

Abstract

En esta Tesis hemos diseñado entidades moleculares basadas en derivados de beta-ciclodextrina y calix[4]areno capaces de formar nanosistemas autoensamblados para su aplicación al transporte y la liberación controladas de fármacos y material génico. Para ello se han ensayado dos estrategias complementarias: la incorporación de elementos estructurales que promuevan la auto-organización mediante métodos de funcionalización selectiva y la formación de complejos supramoleculares que pre-organizan las unidades moleculares y favorecen la formación de nanopartículas, bien de manera espontánea, bien en presencia de un ácido nucleico. La aproximación basada en el uso de prototipos monodispersos permite realizar estudios de relación entre estructura molecular-propiedades de los nanosistemas autoensamblados-eficacia como transportadores de genes y fármacos. Además, los nanocomplejos resultantes son susceptibles de modificación en la superficie con elementos de biorreconocimiento para su vectorización a receptores celulares específicos. - Sistemas auto-ensamblados para la liberación dirigida de fármacos. El éxito en la administración de agentes terapéuticos se basa en el desarrollo de sistemas de encapsulación y liberación de principios activos que sean capaces de mejorar la biodisponibilidad de fármacos insolubles o biodegradables, así como de evitar efectos secundarios mediante el transporte dirigido a receptores celulares específicos. Las ciclodextrinas (CDs) son oligosacáridos cíclicos que tienen la propiedad de complejar moléculas hidrofóbicas en su cavidad y solubilizarlas en medio acuoso, lo que ha sido extensamente empleado en la industria farmacéutica. El diseño basado en la formación de complejos de inclusión presenta dos limitaciones: sólo las moléculas adapatadas al tamaño de la cavidad pueden ser encapsuladas, y la estequiometría está limitada a una relación huésped-anfitrión 1:1. Además, las CDs nativas no son transportadores ideales ya que carecen de propiedades de vectorización hacia receptores biológicos. El desarollo de nanoestructuras funcionales, con capacidad de auto-ensamblarse en condiciones diluídas en agua o en medio acuoso tamponado, representa una interesante alternativa para la construcción de sistemas de liberación de fármacos más versátiles. La estrategia implica la creación de nuevas nanocavidades hidrofóbicas que tengan la posibilidad de encapsular una mayor cantidad de moléculas sin limitaciones de tamaño de las mismas. Los derivados de calixa[4]areno (CA) y de beta--ciclodextrina (beta-CD) son plataformas privilegiadas para esta finalidad debido a su capacidad de formar superestructuras huésped-anfitrión. Así mismo, tienen la posibilidad de ser funcionalizadas para promover su pre-organización controlada a través de interacciones no covalentes. Por ello, hemos desarrollado una síntesis muy eficiente para preparar heterodímeros anfifílicos neutros de CA- beta-CD que son capaces de auto-organizarse en agua para dar nanopartículas. Estas nanopartículas presentan un núcleo interno formado por unidades hidrofóbicas de CA y una capa externa constituida por unidades hidrofílicas de CDs. Los fragmentos de CA promueven el empaquetamiento compacto de cadenas grasas instaladas en la cara inferior del macrociclo en conformación de cono, proporcionando una matriz lipídica donde pueden ser encapsuladas las moléculas hidrofóbicas del fármaco. Por otra parte, las unidades de beta-CD de la superficie de la nanopartícula permite la solubilización del sistema en agua así como la incorporación de ligandos mediante la formación de complejos de inclusión. La capacidad de estos sistemas para encapsular y dar lugar a una liberación controlada de diazepam y docetaxel, así como de ser post-modificados supramolecularmente con glicoligandos derivados de adamantano que reconocen al receptor de manosa de macrófagos humanos, ilustra el potencial que tienen estos nuevos sistemas en nanomedicina. Para optimizar las propiedades de bio-reconocimiento de los glicoligandos empleados en la liberación dirigida de fármacos, se ha llevado a cabo un estudio sobre las bases moleculares del efecto multivalente observado en las interacciones carbohidrato-lectina. Para ello, se han preparado una serie de multigalactósidos con valencias entre una y siete, con diferentes longitudes de espaciador. La afinidad de unión a lectinas de los multímeros, evaluada mediante ensayos ELLA (Enzyme-linked Lectin Assay) usando la lectina de cacahuete PNA (Peanut Agglutinin), fue dependiente de la longitud del espaciador. El efecto multivalente observado en los galactósidos con los espaciadores más largos fue explicado por su capacidad para entrecruzar la lectina PNA, tal y como indicaron los experimentos ELLA tipo sándwich y los ensayos de dispersión dinámica de la luz (DLS). EL mayor efecto multivalente mostrado por los galactósidos de espaciadores más cortos fue estudiado por microscopía de fuerza atómica (AFM), que demostró que el responsable de este comportamiento es un mecanismo de unión y re-captura de los ligandos en los sitios activos de la lectina.

- Sistemas auto-ensamblados para terapia génica. La terapia génica es una estrategia prometedora para el tratamiento de una amplia gama de enfermedades. El objetivo terapéutico es introducir ADN en una célula para expresar o suprimir la expresión de una proteína determinada. Sin embargo, el ADN libre presenta baja permeabilidad de la membrana plasmática e inestabilidad metabólica, por lo que resulta imprescindible el desarrollo de vectores de genes capaces de compactar y proteger el material génico. A pesar de las propiedades superiores que presentan los sistemas transfección basados en vectores virales, los problemas de bioseguridad asociados han llevado al desarrollo de vectores no virales. La mayoría de los vectores sintéticos recogidos en la literatura se basan en sistemas poliméricos cuya naturaleza dispersa representa una desventaja importante para los estudios y aplicaciones fundamentales. Como alternativa, hemos desarrollado moléculas monodispersas capaces de auto-ensamblarse para complejar, condensar y proteger el ADN y la liberarlo en las células. Se han desarrollado métodos de funcionalización selectiva para preparar vectores sintéticos con anfifilicidad facial, que tienen dominios policatiónicos capaces de dar múltiples interacciones con los grupos fosfato de los nucleótidos y grupos funcionales hidrófobos que les proporcionan propiedades de autoensamblado para la condensación y la liberación controlada de material génico. Con estos fines hemos utilizado las plataformas de ciclodextrinas y de calix[4]arenos. Se ha diseñado una primera generación de sistemas transportadores de genes no virales auto-ensamblados mediante la instalación de un grupo xilileno en la cara secundaria de CDs policatiónicas. Los derivados de CDs xililenadas son capaces de auto-ensamblarse en agua para producir dímeros donde las interacciones hidrofóbicas son las fuerzas impulsoras. Se han empleado técnicas de fluorescencia, mecánica y dinámica molecular para estudiar la formación de complejos de 2-naftalencarboxilato de metilo (2MN), una sonda fluorescente, con ciclodextrinas neutras xililenadas que tienen la capacidad de dimerizar. La influencia del motivo de xilileno se evaluó mediante la comparación de los datos de complejación de 2MN por derivados xililenados con los obtenidos por sus homólogos no xililenados. Este estudio preliminar se llevó a cabo para entender mejor las bases moleculares de los procesos de formación de complejos de derivados de CD xililenadas con otros huéspedes, como fármacos o material génico, cuando están implicados procesos de asociación que compiten con los equilibrios de complejación. Cuando se incorporó el fragmento de xilileno en ciclodextrinas policatiónicas, el anillo aromático fue capaz de promover un proceso de dimerización supramolecular dependiente del pH, tal y como demostraron los experimentos de fluorescencia, RMN y dicroísmo circular. La capacidad de los dímeros de condensar ADN de manera reversible para formar nanocomplejos fue confirmada por microscopía de transmisión electrónica (TEM). Tal estrategia de preorganización facilita el auto-ensamblaje de los dímeros en presencia de ADN para formar complejos a un pH neutro. La acidificación desestabiliza los dímeros y, en consecuencia, el conjunto supramolecular de CD-ADN. El carácter dinámico y reversible de las interacciones en juego permite tanto la condensación como la liberación del material génico en la célula. La mayor eficiencia de transfección en células COS-7 exhibida por los derivados xililenados en comparación con sus homólogos permetilados, sugieren que la liberación de ADN en el citoplasma podría estar favorecido por el aumento de la acidez en los endosomas. Una segunda estrategia para proporcionar ciclodextrinas con capacidad de auto-ensamblaje se basa en el diseño de sistemas ternarios consistentes en complejos de inclusion, con estequiometría 2:1, de derivados de bis-adamantano y de cisteaminil- beta-CD. La alta afinidad del fragmento de adamantano por la cavidad de CD permite el anclaje supramolecular a dos unidades CD policatiónicas, por lo que no es necesaria la funcionalización de la cara secundaria de la CD con cadenas lipofílicas para promover la auto-asociación, lo que simplifica el número de etapas sintéticas. La termodinámica de los complejos se ha estudiado mediante RMN, valoración por calorimetría isotérmica (ITC) y cálculos computacionales. Los sistemas supramoleculares complejan el ADN para dar nanopartículas esféricas y homogéneas que protegen el material génico de la degradación por nucleasas. La transfección de células COS-7 y HepG2 confirmó la superioridad de los complejos ternarios respecto la CD policatiónica no anfifílica. Su capacidad de liberación de genes fue superior incluso que la del vector policatiónico polietilenimina, y los niveles de toxicidad fueron despreciables. Se preparó una tercera generación de vectores sintéticos auto-ensamblados mediante la instalación, sobre plataformas de beta-CD y CA, de dominios catiónicos y lipófilos separados Esto permitió el acceso a derivados anfifílicos policatiónicos capaces de auto-organizarse en presencia de ácidos nucleicos para dar nanocondensados en el que el material génico está completamente protegido del medio. Los grupos catiónicos interactúan con los nucleótidos mientras que las cadenas lipófilas ayudan a la compactación a través de interacciones hidrófobas. Imágenes de microscopía de transmisión electrónica revelaron una estructura consistente con un ordenamiento en el que se alternan las cadenas de ADN y bicapas anfifílicas de beta-CD o CA. En ambas series se confirmó la capacidad para formar nanocomplejos mediante microscopía AFM. La aplicación de metodologías de funcionalización química selectiva permite conservar la homogeneidad a nivel molecular, lo que ofrece oportunidades sin precedentes para los estudios de relación estructura-actividad. La incorporación de motivos de arginina se ha encontrado particularmente beneficioso en la serie de calix[4]arenos, mientras que una combinación de grupos amina y tiourea fue la mejor combinación para derivados de beta-CD. Los estudios de transfección in vitro en las líneas celulares de primate COS-7 y de rabdomiosarcoma humano, RD-4, permitió la identificación de candidatos óptimos para terapia génica. Por último, se ha diseñado una cuarta generación de vectores sintéticos basados en la estructura de surfactantes gemelos. Se han preparados dímeros policatiónicos anfifílicos de calix[4]areno covalentemente unidos por un espaciador. Se espera que estos compuestos presenten una mayor capacidad de transfección respecto a sus unidades de monómero correspondiente, como resultado de un efecto quelato y de una disminución de la concentración micelar crítica que dé lugar a una concentración bio-activa inferior a la de los monómeros constituyentes. Las metodologías de funcionalización selectivas utilizadas en la preparación de estos nuevos dímeros pueden ser extendidas para preparar nuevos surfactantes gemelos con el fin de optimizar las propiedades de transfección de los derivados monoméricos.