Diseño y síntesis de sistemas dendríticos para la presentación de biomoléculas de interés terapéutico

Abstract

INTRODUCCIÓN La superficie celular de la mayoría de las células de mamíferos se encuentra recubierta por una densa capa de carbohidratos denominada glicocálix. Estos carbohidratos son moléculas implicadas en numerosos procesos de reconocimiento célula-célula y célula-matriz extracelular a través de sus correspondientes receptores (fundamentalmente mediante una interacción proteína-carbohidrato). En muchos procesos biológicos, tales como la metástasis, la embriogénesis, el proceso de inflamación, la diferenciación celular, etc. los carbohidratos juegan un papel fundamental. Las interacciones de estos carbohidratos con sus receptores son muy selectivas y presentan una fuerte dependencia de cationes divalentes, fundamentalmente calcio, y una baja afinidad, que es compensada por la naturaleza con una presentación multivalente de los carbohidratos. En la bibliografía se encuentran descritos diferentes modelos de sistemas multivalentes con carbohidratos para el estudio de los procesos biológicos en los que están implicados. Entre los sistemas más empleados cabe destacar los calixarenos, los liposomas, las ciclodextrinas, oligómeros y polímeros, las nanopartículas y los dendrímeros, siendo estos últimos el objeto de nuestro trabajo. Los dendrímeros son macromoléculas altamente ramificadas con una estructura bien definida, versátiles y derivatizables, que poseen una alta densidad funcional en su superficie. Además, tienen unas propiedades fisicoquímicas particulares, modulables por las características de los componentes empleados en su formación o por los grupos funcionales presentes en su superficie. Estas propiedades les hacen ser buenos candidatos para ser aplicados en diferentes áreas, tan dispares como la ciencia de los materiales y la biología y biomedicina. Su alta densidad funcional en la superficie los hace interesantes para poder realizar una eficiente presentación multivalente de ligandos biológicos. Si los ligandos utilizados son los carbohidratos, como es nuestro caso, los sistemas se denominan glicodendrímeros. La conjugación directa de glicodendrímeros con biomoléculas inmunogénicas podría dar lugar a interesantes aplicaciones biológicas debido a su doble papel ya que por un lado, los carbohidratos interaccionan con receptores de células dendríticas, activándolas; por otro, estarían funcionalizados con una secuencia inmunogénica que da una respuesta inmune frente a la misma. Dichos sistemas tienen un potencial uso como vacunas y, en función de la biomolécula elegida, la aplicación terapéutica será una u otra. Entre estas biomoléculas podríamos incluir plataformas con gran interés biológico tales como MAPs (Multi-Antigen Peptides), PNAs (Peptide Nucleic Acid), etc. ANTECEDENTES En los últimos años, nuestro grupo de investigación se ha centrado en la preparación de compuestos multivalentes funcionalizados con carbohidratos de la lectina DC-SIGN, inhibiendo de esta manera el proceso de infección viral en distintos modelos celulares. Como soporte para esta presentación multivalente de carbohidratos se han utilizado dendrímeros y dendrones, convenientemente funcionalizados para poder anclar en su superficie numerosas copias de los azúcares seleccionados. OBJETIVOS A la vista de los antecedentes los objetivos que se plantean para este trabajo son: 1. Preparación de glicodendrones funcionalizados adecuadamente para su posterior conjugación a diferentes biomoléculas (MAPs, PNAs). 2. Conjugación de los diferentes glicodendrones preparados sobre plataformas tales como MAPs (Multi-Antigen Peptides), PNAs (Peptide Nucleic Acid), etc. 3. Ensayos biológicos de las moléculas diseñadas. METODOLOGIA Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS La primera metodología a desarrollar consistió en la preparación de un dendrón intermedio basado en el pentaeritritol, que permitía la presentación de tres carbohidratos. Este dendrón presentaba un grupo azida en la posición focal, lo que permitió aumentar la generación de los glicodendrones mediante cicloadición 1,3-dipolar entre azida y alquino (CuAAC) sobre un intermedio común. Así se pudo obtener un glicodendrón de nueve carbohidratos de manera sencilla. Este glicodendrón tenía también en su posición focal un grupo azida lo cual pudo permitir su conjugación a otro tipo de biomoléculas. En principio, como carbohidrato se eligió la manosa pero sería fácilmente sustituible por cualquier otro carbohidrato en función de la diana terapéutica con la que quisiéramos trabajar. Por otro lado, se sintetizaron las biomoléculas de interés a las que queríamos unir nuestros glicodendrones como, por ejemplo, diferentes péptidos y MAPs apropiadamente funcionalizados. Los MAPs o Multiple Antigenic Peptides (MAPs) son construcciones moleculares dendriméricas basadas en esqueletos de polilisina. La lisina (K) es un monómero ideal para la creación de puntos de ramificación en los cuales se pueden acoplar diferentes secuencias peptídicas o epítopos. En la posición focal o cola, se puede funcionalizar con diferentes grupos para su posterior conjugación a otros sistemas. Como epítopos se escogieron diversas secuencias peptídicas. Los péptidos y MAPs se obtuvieron mediante síntesis en fase sólida automatizada y como grupos de la posición focal se eligieron la cisteína (lo cual permitió su conjugación a sistemas dendríticos con malemidas y un alquino en la posición focal. Esquema 1, Método Indirecto) y la bis-homopropargilglicina, que permitió la conjugación directa via CuAAC a los glicodendrones de manosa, dando lugar a glicodendropéptidos (GDP) a través de un método directo. Los sistemas de péptidos conjugados a dendrones de maleimida se conjugaron en un segundo paso a los mismos glicodendrones de manosa, dando lugar a GDPs con valencias incluso mayores, a través de una metodología indirecta Estos sistemas son de gran interés biológico debido a su doble papel: por un lado, los carbohidratos interaccionan con receptores de células dendríticas, activándolas; por otro, están funcionalizados con un péptido inmunogénico que dará una respuesta inmune frente al mismo. Dichos sistemas tienen un potencial uso como vacunas y en función del péptido elegido, la aplicación terapéutica será una y otra. Otro tipo de molécula de interés terapéutico al que se conjugaron los glicodendrones fueron los PNAs. Los ácidos nucleicos peptídicos (Peptide nucleic acids o PNAs) son miméticos de los oligonucleótidos naturales, en los cuales cada unidad de ribosa fosfato está sustituida por una unidad de aminoetilglicina. Las bases nucleicas están unidas a los nitrógenos del esqueleto de aminoetilglicina a través de un grupo metilcarbonilo. Gracias a su cadena neutra, los PNAs muestran una mayor afinidad hacia las cadenas de ácido nucleico complementario (ADN y ARN) que los ácidos nucleicos naturales, siendo también esta interacción más selectiva. Además, los PNAs presentan una estabilidad química y enzimática notablemente mayor a la de los oligonucleótidos naturales. Debido a esta atractiva naturaleza, los PNAs son utilizados a menudo en tecnologías antisentido para inhibir la expresión génica y el crecimiento microbiano con alta especificidad. Aún así, hay todavía ciertos aspectos que mejorar para su aplicación clínica, como por ejemplo, la baja respuesta celular y poca solubilidad en medios fisiológicos. Para solucionar estos problemas, muchos PNAs modificados han sido sintetizados en los últimos años siguiendo diferentes estrategias. En este sentido, la conjugación con glicodendrones a dichos compuestos podría mejorar las propiedades de los PNAs en relación a la respuesta celular y a su solubilidad, siendo a su vez una buena estrategia para conseguir el transporte selectivo hacia una diana terapéutica concreta. Por ello esta nueva aproximación, podría dar lugar a moléculas con un elevado interés en el desarrollo de nuevos antibióticos. La conjugación entre el glicodendrón comentado anteriormente y el PNA tuvo lugar a través de la cicloadición 1,3-dipolar catalizada por Cu(I) entre una azida y un alquino. Para ello, las secuencias de PNA sintetizadas en fase sólida se funcionalizaron con un grupo propargilo en uno de sus extremos. Además, se prepararon controles negativos de etilenglicol los cuales se conjugaron también a los PNAs preparados, para demostrar así que la internalización era debida a interacción de los carbohidratos con las lectinas de la superficie bacteriana. Por último, se decidió conjugar estructuras dendríticas peptídicas como las diseñadas para la construcción de glicodendropéptidos a través del método indirecto, con oligodesoxinucleótidos de interés terapéutico. En concreto, se diseñó una estructura modular funcionalizada que integraba los componentes necesarios para modificar una respuesta inmunológica desde un patrón de respuestas TH2 (alérgica) hacia uno TH1. Básicamente, la estructura consiste en un dendrón que permita la presentación multivalente de un epítopo dominante de células T (péptido alergeno Ole109-130) y un estimulador sintético del receptor TLR9 (ADN-CpG) que desencadene respuestas inmunes mediadas por linfocitos T de tipo TH1. En concreto, se propuso la conjugación directa de ADN CpG (secuencia inmunoestimuladora del receptor TLR9) a un alergeno determinado, en este caso el Ole e 1109-130 (epítopo del polen del olivo), como un método efectivo para inducir la protección profiláctica y terapéutica contra desórdenes atópicos, en este caso, la alergia al polen del olivo (Olea europea). Se pretende con esto evaluar el efecto de la multivalencia en el caso del péptido Ole109-130, así como comprobar si su unión covalente al ADN CpG produce una mayor respuesta por el hecho de ser una única entidad (en el supuesto caso de que module la respuesta del sistema inmune hacia respuestas TH1) que la administración combinada de péptido y ADN CpG sin conjugar. CONCLUSIONES ¿La reacción de cicloadición 1,3-dipolar entre grupos alquino y azida ha demostrado ser muy eficiente y robusta en la construcción de sistemas multivalentes a través de una aproximación convergente empleando carbohidratos desprotegidos. De esta manera se ha podido acceder fácilmente a sistemas multivalentes monodispersos de manera eficaz, pudiéndose llegar a intermedios clave en escala de gramos. Además, se ha demostrado la versatilidad química de dicha reacción, permitiendo la conjugación entre sistemas complejos como glicodendrones, MAPs y PNAs. ¿Se han desarrollado tres rutas complementarias y eficientes para la preparación de sistemas de glicodendropéptidos (GDPs) con hasta 9 copias de manosa y 16 de péptido basándonos en la química click con un control total de la valencia y de la estructura. ¿Por último, se han desarrollado sistemas híbridos de glicodendrón-PNA (Peptide Nucleic Acid) con posibles aplicaciones en el campo del desarrollo de antibióticos.