Repositorio de producción científica de la Universidad de Sevilla

Regulación por dexametasona del canal de ca2 + tipo t cav3.2 en cardiomiocitos. Implicaciones en la hipertrofia cardíaca

 

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dc.contributor.advisor Castellano Orozco, Antonio Gonzalo es
dc.creator Falcón Boyano, Débora es
dc.date.accessioned 2016-09-20T11:49:25Z
dc.date.available 2016-09-20T11:49:25Z
dc.date.issued 2016-06-01
dc.identifier.citation Falcón Boyano, D. (2016). Regulación por dexametasona del canal de ca2 + tipo t cav3.2 en cardiomiocitos. Implicaciones en la hipertrofia cardíaca. (Tesis doctoral inédita). Universidad de Sevilla, Sevilla.
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/11441/45150
dc.description.abstract Los glucocorticoides son hormonas esteroideas necesarias para la vida que son sintetizadas y liberadas por la glándula adrenal de manera circadiana y en respuesta al estrés (ayuno, hipoglucemia, lesiones físicas, ansiedad y/o miedo). Debido a su potente acción antiinflamatoria e inmunosupresora, los glucocorticoides sintéticos constituyen uno de los grupos de fármacos más ampliamente prescritos en el mundo. También se usan para prevenir el rechazo en el trasplante de órganos y para combatir el cáncer del sistema linfático. Los glucocorticoides difunden a través de la membrana plasmática y se unen en el citoplasma a su receptor (GR, receptor de glucocorticoides, ó MR, receptor de mineralocorticoides), provocando su activación. Una vez activo, actuará de forma directa como factor de transcripción provocando la activación o represión de genes, o de forma indirecta activando o inactivando a otros factores de transcripción que regularán la expresión de otros genes. Su beneficio terapéutico está limitado por sus efectos adversos, entre ellos la producción de hipertrofia cardíaca. Aunque, por otro lado, los glucocorticoides pueden tener efectos cardioprotectores mediante la inhibición de la apoptosis de los cardiomiocitos en determinadas situaciones patológicas. Los efectos de los glucocorticoides sobre los cardiomiocitos y los fibroblastos cardíacos son poco conocidos. Los miocitos cardíacos expresan principalmente canales de calcio tipo L o de alto umbral, que son los responsables de la entrada de calcio al citoplasma durante la meseta del potencial de acción y, por tanto, de la contracción. Por otro lado, los canales de calcio tipo T, o de bajo umbral, se expresan en las células del tejido excito-conductor durante toda la vida, pero en el miocardio sólo lo hacen durante el desarrollo embrionario y el período perinatal, estando prácticamente ausentes en los individuos adultos. No obstante, existen evidencias que demuestran que, en el adulto, pueden expresarse de novo en ciertas situaciones patológicas, aunque los mecanismos de reexpresión son poco conocidos. Dentro del grupo de los canales de calcio tipo T se han identificado tres miembros, denominados Cav3.1 a Cav3.3. Las subunidades principales, formadoras del poro, de cada uno de estos canales se denominan a1G, a1H y a1I. En el corazón sólo se expresan los subtipos Cav3.1 y Cav3.2, siendo el subtipo Cav3.2 (a1H) el reexpresado en situaciones de hipertrofia secundaria a la hipertensión, infarto de miocardio e insuficiencia cardíaca. El objetivo de esta tesis doctoral ha sido analizar el efecto de la dexametasona (un glucocorticoide sintético ampliamente utilizado) sobre la expresión del canal de Ca2+ tipo T Cav3.2 en cardiomiocitos de rata. Para el abordaje de este objetivo, en primer lugar se ha analizado el efecto de la dexametasona sobre el nivel de ARNm de los canales de Ca2+ tipo T en cardiomiocitos y fibroblastos de ratas neonatales y adultas. Se ha observado un aumento selectivo del subtipo Cav3.2, con pequeñas modificaciones en el subtipo Cav3.1 en todos las células mencionadas anteriormente. Este aumento de expresión por dexametasona depende de la dosis aplicada y del tiempo de exposición de la misma. Los resultados indican que el aumento del nivel de ARNm del canal Cav3.2 por dexametasona no es debido a un aumento de la estabilidad del ARNm durante la aplicación de la misma, sugiriendo que se debe a un aumento de la tasa de transcripción de este gen. Mediante el uso de inhibidores específicos del MR (espironolactora) y del GR (RU-38486) se ha demostrado que el aumento de expresión del canal de Ca2+ tipo T Cav3.2 depende de la activación del GR, y además mediante el uso del inhibidor de NFkB (PDTC) se ha observado que este factor de transcripción no interviene en el aumento de expresión del canal. Por tanto, el GR no actúa a través de NFkB sobre el promotor de CaV3.2, sino que el GR ejerce una acción directa sobre el promotor del gen CACNA1H. Mediante un estudio in silico se han encontrado posibles sitios de unión del GR al promotor del gen CACNA1H (que codifica el canal Cav3.2). Se han realizado estudios de la actividad transcripcional del promotor mediante el sistema reportero firefly luciferase y luciferase de Renilla. Para ello, se han clonado fragmentos de distintos tamaños del promotor (3 Kb de máximo) en el plásmido pGL3 basic en posición 5´ del gen firefly luciferase y se han transfectado en cardiomiocitos neonatales. Mediante la generación de deleciones de los posibles sitios de unión del GR en el promotor del gen CACNAH, se ha encontrado una región de 21 pb (5´-AAGGGGCGGCGCGCGAGAAAA-3) dentro del promotor de 1,4 Kb donde se encuentra el sitio de unión del GR (GRE), que provoca el aumento de la actividad luciferasa del promotor clonado de 1,4 Kb y que, por tanto, interviene en el aumento del nivel de ARNm de Cav3.2 generado por la dexametasona. Con el fin de analizar funcionalmente los efectos de la dexametasona sobre los canales de Ca2+ tipo T en cardiomiocitos se realizaron experimentos electrofisiológicos. Para ello se utilizó la técnica de patch-clamp en la configuración de whole-cell ó célula completa. Se ha observado que los cardiomiocitos neonatales presentan corrientes de calcio tipo T en situación basal, pero esta corriente aumenta de amplitud cuando estas células se incuban con dexametasona (100 nM durante 24 h). Además, el aumento de corriente de Ca2+ tipo T ocasionado por la dexametasona es debido a un aumento de la corriente a través de los canales Cav3.2, y no Cav3.1, ya que mediante el uso de 50 M NiCl2 (bloqueante no específico que a bajas concentraciones inhibe el subtipo Cav3.2) se produce un fuerte bloqueo de la corriente, mayor que en condición control. También se realizaron registros electrofisiológicos en los que se observó que la corriente tipo T es prácticamente indetectable en las células del animal adulto en situación control, pero tras la incubación con dexametasona (100nM durante 48 h) los cardiomiocitos adultos presentan corrientes de calcio tipo T. Debido a que existen datos previos que sugieren la implicación de los canales de calcio tipo T en procesos proliferativos e hipertróficos, y que los glucocorticoides producen hipertrofia cardiaca, se realizaron experimentos para analizar la posible implicación de los canales tipo T en este proceso. En los cardiomiocitos neonatales incubados con dexametasona no se observaron diferencias en la tasa proliferativa respecto a las células control. Sin embargo, se observó un mayor crecimiento de dichas células al ser incubadas con 100 nM dexametasona durante 72 h, observándose un aumento del área transversal celular y un aumento del nivel de ARNm de los marcadores de hipertrofia ANF, β-MHC y SKA (genes fetales que se reexpresan bajo condiciones de hipertrofia). Además, mediante el uso del NiCl2, nuestros resultados sugieren que el aumento de expresión del canal Cav3.2 producido en cardiomiocitos por la dexametasona puede estar ligado al proceso hipertrófico que se observa en los cardiomiocitos neonatales. En el corazón, además de miocitos, hay otros tipos celulares, siendo los fibroblastos los principales. Se trata de células con una baja tasa proliferativa que se encargan del mantenimiento de la matriz extracelular. Los fibroblastos, en respuesta a diversos tipos de estrés, presentan una modificación fenotípica con expresión de marcadores característicos de la célula muscular lisa, como el aumento de la a-actina de músculo liso (a-sma), por lo que se les denomina miofibroblastos. Estos producen y liberan sustancias como factores de crecimiento, citoquinas, proteínas de la matriz extracelular (como el colágeno tipo I y tipo III) y proteasas. Existen evidencias de que en el animal completo, la dexametasona produce un aumento del colágeno en el corazón como consecuencia de un aumento de la fibrosis. Debido a esto se han realizado experimentos in vitro con cultivos de fibroblastos cardíacos adultos para estudiar el efecto de la dexametasona sobre estas células y analizar si se produce la diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos productores de colágeno, tal como ocurre en el corazón completo como consecuencia del proceso hipertrófico. Al contrario que en el animalcompleto, en fibroblastos cardíacos adultos en cultivo, en presencia de dexametasona se produce una inhibición de la diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos, inducida en respuesta al estrés ocasionado por la presencia de 1% de suero, ya que se produce una disminución de -sma y una disminución del nivel de ARNm del colágeno tipo I y tipo III. Además, se observa que la proliferación no varía a las 24 h de tratamiento, pero a las 48 h y 72 h hay una disminución de un 20% y un 30%, respectivamente, de la capacidad proliferativa en las células incubadas con dexametasona respecto a las células controles. Para estudiar si los efectos antes mencionados de la dexametasona no se producen sólo en células en cultivo sino que ocurre también en el animal in vivo se ha realizado un modelo animal de exceso de glucocorticoides. Se usaron ratas Wistar de 200 g de peso a las que se les realizaron inyecciones diarias (0,35 ug/g de animal) de dexametasona 21-fosfato. Mediante medidas ecocardiográficas se estudiaron parámetros como la fracción de eyección, el diámetro del septo y la relación E/A. Todos ellos revelaron signos de hipertrofia cardíaca en las ratas tratadas con dexametasona 21-P durante 12 días. Además, mediante estudios histológicos, se estudio la hipertrofia a nivel celular, y se observó un aumento del tamaño celular ocasionado por el tratamiento con dexametasona 21-P en las ratas tratadas durante 12 días, corroborando los resultados obtenidos anteriormente. Se estudió el nivel de expresión del subtipo Cav3.2 en el animal in vivo observándose un incremento de expresión del transcrito en las ratas tratadas a los 3 días de tratamiento con dexametasona 21-P y manteniéndose tras los 12 días. La regulación por dexametasona del subtipo Cav3.2 es un fenómeno que ocurre también en el animal completo, y no únicamente en células en cultivo, aumentando la relevancia fisiológica de este fenómeno que, además, precede a la aparición de los primeros signos de hipertrofia. Se realizaron registros electrofisiológicos de células dispersas del animal tratado durante 3 días con dexametasona 21-P. Observándose un incremento significativo de la densidad de corriente tipo T. Estos datos demuestran que el tratamiento del animal con dexametasona 21-P durante 3 días induce un aumento de la densidad de corriente de Ca2+ tipo T, probablemente como consecuencia de la reexpresión del canal Cav3.2 y reflejando un aumento del número de canales funcionales en la membrana. Por lo tanto, en el animal completo ocurre el mismo fenómeno que el observado en cardiomiocitos ventriculares adultos y neonatos en cultivo tras la exposición a dexametasona. es
dc.format application/pdf es
dc.language.iso spa es
dc.rights Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional *
dc.rights.uri http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ *
dc.title Regulación por dexametasona del canal de ca2 + tipo t cav3.2 en cardiomiocitos. Implicaciones en la hipertrofia cardíaca es
dc.type info:eu-repo/semantics/doctoralThesis es
dc.type.version info:eu-repo/semantics/publishedVersion es
dc.rights.accessrights info:eu-repo/semantics/openAccess es
dc.contributor.affiliation Universidad de Sevilla. Departamento de Fisiología Médica y Biofísica es
dc.contributor.group Universidad de Sevilla. CTS591: Fisiopatologia Molecular del Sistema Cardiovascular
idus.format.extent 193 p. es
dc.identifier.idus https://idus.us.es/xmlui/handle/11441/45150
Size: 230.4Mb
Format: PDF

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