Estudio de los mecanismos que coordinan la actividad de los centros organizadores de microtúbulos de las células animales

Abstract

La organización del citoesqueleto de microtúbulos (MTs) así como el control del número absoluto de éstos es esencial en la regulación de diferentes procesos celulares tales como la división celular, el trasporte direccional de proteínas o el establecimiento de la polaridad celular. La distribución de esta red no se establece de forma aleatoria, sino que depende de la localización y activación de los sitios intracelulares desde donde los MTs son nucleados. Esta nucleación tiene lugar en estructuras morfológicas definidas que se denominan centros organizadores de microtúbulos (MTOCs) (Lüders and Stearns 2007). En células animales en división, el centrosoma actúa como el principal MTOC celular (Bornens 2002), sin embargo, el Aparato de Golgi (AG) también presenta capacidad para nuclear MTs en células en interfase (Efimov et al. 2007). La actividad de estos dos sitios de nucleación de MTs varía a lo largo del ciclo celular sugiriendo la existencia de algún tipo de regulación coordinada de sus respectivas actividades. AKAP450, CDK5Rap2 y pericentrina (PCNT) son tres de las principales proteínas descritas como posibles reguladoras de dicho mecanismo de nucleación y presentes en ambos orgánulos. Así, en esta tesis, hemos llevado a cabo un análisis de los mecanismos implicados en el control del comportamiento coordinado de los diferentes MTOCs celulares combinando la eliminación de estos tres principales factores reclutadores de complejos γTuRC (AKAP450, CDKRap2 y PCNT) y el uso del recientemente descubierto inhibidor de PLK4 (proteína esencial en la duplicación del centrosoma) centrinona. Los resultados presentados demuestran que las proteínas implicadas tradicionalmente en el reclutamiento de complejos γTuRC no son esenciales para la nucleación de MTs desde el centrosoma en interfase; mientras que sí van a controlar esta función en el AG. Varias líneas argumentales apoyan esta conclusión. Primera, la inhibición de la expresión de AKAP450, CDK5Rap2 y PCNT en células hTERTRPE1 no afecta a los niveles de nucleación desde el centrosoma ni al reclutamiento de γ-tubulina. Centrosomas carentes de las tres proteínas son capaces de nuclear MTs a ratios normales gracias a la función de CEP192; quién sí parece ejercer una contribución importante pero no esencial en este mecanismo. Segunda, células carentes de estas cuatro proteínas aún presentaban cierta capacidad de nucleación de MTs desde el centrosoma, lo que demuestra la existencia de mecanismos adicionales a los generalmente considerados cómo canónicos. Tercero, en el caso del AG, es ya conocido que su capacidad para nuclear MTs depende de la presencia de AKAP450 (Rivero et al. 2009), y nuestros resultados demuestran que tanto CDK5Rap2 como pericentrina también influyen en estos niveles. Así, células carentes de CDK5Rap2 presentaban una menor capacidad de nucleación desde el AG mientras que en el caso de la ausencia de pericentrina, esta actividad se veía claramente potenciada; lo que indica el papel inhibitorio de la proteína. Ensayos de coinmunoprecipitación revelaron la existencia de dos tipos de complejos capaces de reclutar γTuRCs; aquellos basados en AKAP450 y los basados en pericentrina. Ambos desempeñan funciones antagónicas en los mecanismos de nucleación desde el AG y son totalmente dispensables en el papel del centrosoma como MTOC. Es conocido que en procesos de diferenciación celular los diferentes MTOCs experimentan mecanismos de desregulación, permitiendo potenciar o limitar su actividad de manera controlada. Nuestros resultados apoyan la idea de que la nucleación de MTs es un proceso con una jerarquía intrínseca en la que el centrosoma ocupa un lugar principal. Ensayos con la droga centrinona RESUMEN 10 demostraron que la ausencia de centrosoma provoca una estimulación significativa de la nucleación de MTs desde el AG; mientras que la presencia de centrosomas extras inhibe dicho mecanismo. Así, la pérdida o ganancia de centrosomas tiene un impacto en el comportamiento como MTOC del AG; situación que no ocurre de forma inversa como por ejemplo cuando se inhibe la nucleación de MTs desde el AG mediante la eliminación de AKAP450. Dado que la ausencia de PCNT estimula la capacidad de nucleación del AG de forma similar a cómo lo hace la ausencia del centrosoma, aunque en menor grado; nuestros datos parecen indicar que el efecto regulatorio del centrosoma sobre la función del AG podría estar mediado por el reclutamiento de la propia pericentrina a esta localización. En este sentido, nuestros experimentos también revelaron cómo los MTs son nucleados en células con sus dos principales MTOCs inactivos. Así, en estas condiciones, observamos la formación de estructuras acentriolares bien definidas capaces de nuclear MTs desde localizaciones discretas no asociadas ni al AG ni al centrosoma. El análisis en profundidad de dichas estructuras reveló que estos MTOCs acentriolares no se originan por un simple incremento de los niveles citoplásmicos o la localización ectópica de las proteínas centrosómicas; sino que presentan un claro ensamblaje regulado siendo la pericentrina un componente esencial y necesario para su conformación. En todos los casos, el proceso de nucleación siempre era dependiente de γ-tubulina. Finalmente, los estudios con centrinona mostraron que bajo cualquier condición experimental que implicara la ausencia de centrosomas, la densidad de MTs celular se duplicaba en comparación a las condiciones controles. Incremento que se observa independiente del sitio desde donde los MTs son nucleados; ya sea el AG (células controles tratadas con centrinona) o los MTOCs citoplásmicos (células akap450 knock-out sin centrosoma). Estos datos indican que el centrosoma parece controlar el número absoluto de MTs existente en la célula, así como la distribución espacial de éstos, no sólo por medio de un proceso de nucleación activa, sino en parte también al actuar a modo de regulador negativo de la actividad de los demás MTOCs alternativos. Sorprendentemente, este incremento de la densidad de MTs generada por la ausencia de centrosomas no se repite en células carentes de pericentrina, sugiriendo que ésta constituye un factor clave en la conexión y regulación del efecto que la pérdida del centrosoma tiene en la capacidad de nucleación de MTs desde el AG. Así, en este trabajo revelamos la existencia de un mecanismo mediante el cual el centrosoma es capaz de controlar el número y la distribución espacial de los MTs de células en interfase. Regulación que lleva a cabo no sólo controlando su propia actividad, sino también la de otros MTOCs alternativos; especialmente el AG. Por su parte nuestros resultados parecen también indicar que la pericentrina desempeña un papel esencial en esta regulación, actuando a modo de coordinador global del conjunto del proceso de nucleación de MTs.