dc.description.abstract | La viabilidad de las células depende del buen funcionamiento de un conjunto de
mecanismos moleculares que controlan los procesos biológicos. La ubicuitilación
de las proteínas permite degradar rápidamente los componentes reguladores de
estos mecanismos, contribuyendo a la precisa sincronización de los complejos
procesos celulares. Dada esta crítica función, la desregulación de la degradación
de las proteínas está implicada en la transformación tumoral, entre otras
enfermedades. Las ligasas de ubicuitina son las responsables de reconocer los
sustratos que serán poliubicuitilados y degradados. En esta Tesis nos hemos
centrado en el estudio de nuevos sustratos y funciones de dos proteínas F-box del
SCF fundamentales en el control del ciclo celular: FBXW7 y βTrCP. En concreto,
se presentan los resultados obtenidos del análisis de la degradación dependiente
de estas proteínas F-box de tres importantes reguladores de la proliferación
celular, PLK1, CDK1 y p53. Se analizan las consecuencias sobre el ciclo celular, y
se discute su posible influencia en la formación de tumores o su utilidad como
marcadores predictivos o dianas para tratamientos terapéuticos.
PLK1 es una quinasa de serina/treonina implicada en diversas etapas del ciclo
celular, con importantes funciones en la regulación de la mitosis y la replicación del
ADN. En resultados previos de nuestro grupo de investigación determinamos que
la proteína PLK1 nuclear es ubicuitilada por SCF(FBXW7) y degradada por el
proteasoma en respuesta a los daños en el ADN, lo que impide la formación de los
complejos de pre-replicación y, por tanto, la proliferación celular. Durante el
transcurso de ese estudio, descubrimos que la ligasa SCF(βTrCP) también
ubicuitila a PLK1, por lo que nos dispusimos a estudiar esta potencial degradación
de PLK1 y cómo afectaba al ciclo celular. Partimos de la observación de que el
tratamiento de las células con geldanamicina, que inactiva específicamente la
función chaperona de la proteína de choque térmico HSP90, afecta a la estabilidad de PLK1. En concreto, el tratamiento de las células con geldanamicina potencia la
degradación de PLK1 por el proteasoma. Sin embargo, comprobamos que en esta
degradación no están implicadas ni APC/C ni SCF(FBXW7), las únicas ligasas de
ubiquitina de PLK1 descritas hasta el momento. Estudiamos, pues, si SCF(βTrCP)
podía ser responsable de la degradación de PLK1 en esas condiciones. Así,
constatamos que βTrCP y PLK1 forman un complejo in vivo mediante interacción
directa y que βTrCP induce la poliubicuitilación de PLK1 y su degradación a través
del proteasoma. Además, ensayos de silenciamiento y de sobreexpresión, y
estudios de subfraccionamiento y de sincronización celular indicaron que
SCF(βTrCP) ubicuitila a la fracción citoplasmática de PLK1, esencialmente en las
fases G1 y S del ciclo celular. Identificamos a CDK1, que también es sustrato de
HSP90, como la principal quinasa implicada en este proceso. PLK1 solo puede
degradarse debido al tratamiento con geldanamicina a corto plazo, ya que
posteriormente CDK1 es también degradada y, por tanto, PLK1 se acumula. Se
trata, pues, de una degradación transitoria y estrictamente regulada. Finalmente,
estudiamos la relevancia fisiológica de esta degradación. Descubrimos que la
inhibición de HSP90 retrasa el avance del ciclo celular en la transición G1/S, a
través de la degradación de PLK1 mediante SCF(βTrCP)/proteasoma. Este retraso
se debe a que, en estas condiciones, CDH1 no se degrada por PLK1 y los
sustratos de APC/C(CDH1) necesarios para la transición G1/S no se acumulan.
Estos resultados han sido publicados en The FASEB Journal (Giráldez S, Galindo-
Moreno M, Limón-Mortés MC, Rivas AC, Herrero-Ruiz J, Mora-Santos M, Sáez C,
Japón MÁ, Tortolero M, Romero F. (2017). G1/S phase progression is regulated by
PLK1 degradation through the CDK1/βTrCP axis. The FASEB Journal 31: 2925-
2936).
CDK1 es otra quinasa esencial en la regulación del ciclo celular. En estudios
previos de nuestro grupo se demostró que CDK1 es ubicuitilada por SCF(βTrCP) y
degradada por el lisosoma, lo que contribuye a mantener constantes los niveles de
la proteína en las diferentes fases del ciclo celular. Además, el daño en el ADN
puede inducir la degradación o el incremento de CDK1 dependiendo del tipo
celular. En el presente estudio caracterizamos molecularmente la degradación de
la proteína utilizando como modelo una línea celular tumoral de cáncer de mama y otra no tumoral derivada de tejido mamario normal humano. En ambas líneas, el
tratamiento con diferentes agentes quimioterapéuticos empleados en clínica o con
agentes que provocan estrés proteolítico indujo la degradación de CDK1. Esta
proteólisis está mediada por la vía de la autofagia selectiva, ya que tanto la
inducción de la autofagia como su bloqueo afectan al nivel de la proteína. Así,
cuando se estimula la autofagia tratando las células con trehalosa observamos una
disminución de CDK1. En los experimentos complementarios, el bloqueo del
lisosoma con concanamicina A o bafilomicina A1 produjo el incremento de los
niveles de la quinasa. El bloqueo del proteasoma a corto plazo también induce la
degradación de CDK1 por la ruta de la autofagia. Sin embargo, cuando se bloquea
el proteasoma a tiempos más largos, CDK1 se insolubliza formando parte de una
estructura denominada agresoma, previamente a su degradación por el lisosoma.
Para conocer el mecanismo molecular implicado en la degradación de CDK1 por
autofagia, se disminuyó la cantidad de proteínas LC3 o p62, dos proteínas
esenciales para esta ruta de degradación, mediante ensayos de silenciamiento.
Tanto la disminución de p62 como la de LC3 produjeron un incremento de CDK1.
Esto sugería una interacción de CDK1 con la maquinaria de la autofagia, que se
confirmó al realizar ensayos de coinmunoprecipitación de CDK1 con ambas
proteínas en células tratadas con inhibidores de las enzimas lisosomales. Se
comprobó que efectivamente CDK1, p62 y LC3 forman un complejo in vivo.
Asimismo, detectamos una interacción entre CDK1 y HDAC6, otra proteína de la
maquinaria de la autofagia que, entre otras cosas, permite la acumulación de
proteínas poliubicuitiladas en los agresomas para su posterior degradación por el
lisosoma. Estas interacciones, además, son dependiente de βTrCP, ya que el
mutante de CDK1 en su fosfodegrón pierde la capacidad de unirse a p62, LC3 y
HDAC6. Finalmente, ensayos de subfraccionamiento mostraron que tanto CDK1
como p62 y HDAC6 se encuentran en gran medida en la fracción insoluble cuando
se tratan las células con un inhibidor del proteasoma a largo plazo. Se corroboró la
co-localización de estas tres proteínas en los agresomas, en estas condiciones,
mediante microscopía confocal. Estos resultados han sido publicados en Scientific
Reports (Galindo-Moreno M, Giráldez S, Sáez C, Japón MÁ, Tortolero M, Romero
F. (2017). Both p62/SQSTM1-HDAC6-dependent autophagy and the aggresome
pathway mediate CDK1 degradation in human breast cancer. Scientific Reports 7:
10078). TP53 es el gen que aparece más frecuentemente mutado en los cánceres
humanos. Funciona como un sensor de la integridad del genoma y es activado por
diferentes formas de estrés celular como la hipoxia, los cambios de pH y, sobre
todo, los daños en el ADN. La proteína actúa deteniendo el ciclo celular para la
reparación de los daños, o induciendo apoptosis si los daños son irreparables.
Nuestro grupo identificó a p53 como un potencial sustrato de SCF(FBXW7) en
ensayos de espectrometría de masas. En esta Tesis comprobamos por
coinmunoprecipitación directa e inversa que ambas proteínas interaccionan in vivo
y que SCF(FBXW7) poliubicuitila a p53 induciendo su degradación. Además, en la
secuencia primaria de p53 encontramos hasta 4 posibles CPDs y, mediante
mutagénesis dirigida, determinamos cuál de ellos es el responsable de la unión a
la ligasa. Ese motivo, y concretamente la serina 33, requiere ser fosforilado por
GSK3β para que p53 sea reconocida por SCF(FBXW7) y degradada. Observamos
que, en condiciones de cultivo no estresantes, SCF(FBXW7) interviene, pero poco,
en la degradación de p53. Por tanto, para averiguar la relevancia de la degradación
de p53 debida a FBXW7 estudiamos su papel tras someter a las células a agentes
que producen daños en el ADN. Aparentemente, SCF(FBXW7) no participa en la
degradación de p53 inmediatamente después de tratar a las células con radiación
UV, pero sí contribuye a su degradación a largo plazo, probablemente después de
haberse reparados los daños, permitiendo la recuperación de la proliferación
celular. Habida cuenta que la presencia de FBXW7 reducía la apoptosis mediada
por p53 tras daños en el ADN, examinamos la posible influencia de la amplificación
de FBXW7 en la supervivencia de pacientes con distintos tipos de cáncer,
utilizando los datos disponibles en las bases de datos de cBioPortal. El análisis de
un amplio número de casos de pacientes con tumores de mama que portan TP53
silvestre muestra que la presencia de FBXW7 amplificado disminuye
significativamente la supervivencia. Sin embargo, no se encontró diferencia
significativa en la supervivencia entre pacientes con TP53 mutado/FBXW7
amplificado y TP53 mutado/FBXW7 silvestre, lo que corrobora que la nueva
función de FBXW7 se ejerce a través de p53. Estos resultados están sometidos a
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