El método inmunoperoxidasico en el diagnóstico citológico de los síndromes linfoproliferativos

Abstract

Los métodos llamados inmunoperoxidásicos han supuesto un notable avance en los campos de la inmunohistoquímica y de la inmunocitoquímica, aventajando a la inmunofluorescencia en sensibilidad y en la posibilidad de visualizar los rasgos morfológicos de las células. Entre los métodos inmunoperoxidásicos destaca, por su gran sensibilidad y elevada especificidad, el método del PAP ó de Sterberger, desarrollado por este autor al principio de la década de los setenta. En los últimos años, este método se ha intentado adaptar a extensiones celulares hematológicas con resultados hasta la fecha irregulares. En esta Tesis, el motivo de la proposición ha sido llevar a cabo una adaptación del método mencionado en extensiones hematológicas secadas al aire, para demostrar el contenido celular de inmonoglobulinas. El estudio experimental se ha realizado en treinta y tres pacientes diagnosticados de diversos síndromes linfoproliferativos malignos (leucemia linfoide crónica, leucemia de células linfosarcomatosas, leucemia linfoblástica aguda, síndrome de Sézary, mieloma, macroglobulina de Waldeström y linfomas) y benignos (plasmocitosis reactiva), y en dos donantes de sangre sanos. En el presente estudio se han evaluado los efectos de la fijación sobre la antigenicidad de las inmunoglobulinas y sobre la morfología celular, ensayándose un total de nueve fijadores. Destaca la conservación de la antigenicidad de los anticuerpos lograda con el formaldehido-clacio de Baker, demostrada especialmente en siete enfermos con leucemia linfoide crónica, y que supera claramente los resultados de la inmunofluorescencia directa. Asimismo se han valorado tres métodos diferentes para inhibir la actividad peroxidásica endógena de la preparación, sesenta variantes dilucionales de antisueros, cinco métodos de contratinción y pruebas cronológicas adicionales. Los aspectos técnicos y conceptuales son discutidos. CONCLUSIONES 1. Hemos realizado una adaptación del método inmunoperoxidásico del PAP (complejos solubles peroxidasa-antiperoxidasa) en extensiones hematológicas. El método desarrollado se ha aplicado a la demostración de inmunoglobulinas y de lisozima a nivel celular. 2. El método obtenido implica una simplificación técnica y cronológica, a la vez que un aumento de la sensibilidad unido a la conservación de la elevada especificidad de la inmunotinción. De fácil reproductibilidad, es asequible técnicamente a la mayoría de los laboratorios dedicados al estudio de la citología hematológica. 3. La fijación constituye un importante parámetro a valorar en todo método inmunocitoquímico. Consideramos como más adecuados el formaldehido-calcio en las extensiones de concentrado de linfocitos, e indistintamente la acetona al 60% en frio y el formaldehido-acetona en los aspirados de la médula ósea. 4. La contratinción es un aspecto a considerar en la evaluación de los resultados. La hematoxilina de Harris es la tinción más adecuada para los concentrados linfocitarios, en tanto que en los aspirados medulares se obtienen unos resultados morfológicos óptimos con una asociación de May-Grünwald y hematoxilina de Harris. 5. El estudio inmunoperoxidásico de anticuerpos en extensiones de concentrados linfocitarios de pacientes diagnosticados de leucemia linfoide crónica, demuestra una casi absoluta superioridad del formaldehido-calcio sobre el formaldehido-acetona tamponado al mejorar la conservación de la antigenicidad de las inmunoglobulinas celulares. 6. La solución tamponada de formaldehido-acetona supera al formaldehido-calcio en la calidad morfológica de los resultados y en la posibilidad de demostrar la existencia de inclusiones cristalinas de inmunoglobulinas intracitoplásmicas. 7. En el estudio de linfocitos de la leucemia linfoide crónica, la demostración de inmunoglobulinas por el método inmunoperoxidásico en extensiones fijadas en formaldehido-calcio, supera en sensibilidad a la inmunofluorescencia directa. 8. El método inmunoperoxidásico del PAP, aplicado a las extensiones celulares hematológicas, logra distinguir simultáneamente la presencia de inmunoglobulinas de superficie e intracitoplásmicas, definiéndose como un método capaz de caracterizar el estudio morfológico y funcional del linfocito B, y por tanto susceptible de ser realizado con fines diagnósticos y pronósticos en los síndromes linfoproliferativos malignos. 9. La demostración inmunocitoquímica de lisozima puede ser empleada como marcador de exclusión de la estirpe linfoide, a la vez que facilita la distinción de los monocitos y macrófagos, y permite catalogar el estadio funcional de maduración de los granulocitos. 10. En el estudio de pacientes con gammapatías monoclonales malignas, existe en general una buena correlación entre la paraproteina identificada en el suero y la inmunoglobulina predominante en los elementos linfoides neoplásicos. 11. Tanto en las extensiones de la sangre periférica como en las de los aspirados de médula ósea, observamos una tinción poliespecífica para cadenas pesadas y ligeras en los granulocitos neutrófilos y en los monocitos (no en todos), que interpretamos como consecuencia de la presencia de complejos inmunes antígeno-anticuerpo.