Transferencia genética en bacterias halófilas moderadas. Caracterización y clonación de una α-amilasa producida por Halomonas meridiana

Abstract

Durante las dos últimas décadas, nuestro Equipo de Investigación se ha centrado en el estudio de los microorganismos halófilos, tanto extremos como moderados. En general, las bacterias halófilas moderadas, aquellas que crecen ópticamente en medios que contienen un 3-15% de sal, han sido objeto de un gran número de estudios taxonómicos, fisiológicos y ecológicos (Kushner y Kamekura, 1988,l Rodríguez-Valera, 1991; Vreeland y Hochstein, 1993; Ventosa y col., 1998b). Así, en nuestro laboratorio se ha descrito un elevado número de especies halófilas moderadas (Garcia y col., 1987; Ventosa y col., 1989a, 1989b, 1990, 1992; Márquez y col., 1990; Spring y col., 1996; Garabito y col., 1997) y se han realizado importantes aportaciones en cuanto a sus relaciones taxonómicas y filogenéticas (Ventosa y col., 1982, 1983, 1984; Márquez y col., 1987; Mellado y col., 1995a, 1996; Mota y col., 1997). Sin embargo, son muy escasos los estudios disponibles sobre la genética de este grupo de microorganismos halófilos, habiéndose obtenido la mayoría de los datos al respecto en los últimos años. Así, se han descrito diversos plásmidos autóctonos (Fernández-Castillo y col., 1992; Mellado y col., 1997; Llamas y col., 1997; Louis y Galinski, 1997), utilizándose algunos de ellos para la construcción de diversos vectores de clonación útiles para este grupo bacteriano (Vargas y col., 1995; Mellado y col., 1995c), y se han realizdo estudios de promotores en estas bacterias (Arvanitis y col., 1995; Tegos y col., 1997). A pesar de estos avances, los conocimientos que se poseen sobre los mecanismos de transferencia de material genético entre ellas, tanto en sus hábitats naturales como en condiciones de laboratorio, son muy escasos, lo que dificulta enormemente su manipulación genética con fines aplicados. A este respecto, es importante destacar el papel fundamental que juegan los compuestos antimicrobianos como marcadores en estudios de intercambio genético. En el caso de las bacterias halófilas moderadas, se ha demostrado que cuando crecen a su óptima concentración salina, generalmente alrededor del 10% de sales, son capaces de tolerar elevadas concentraciones de compuestos antimicrobianos (Nieto y col., 1993). Este hecho dificulta el uso de los mismos como marcadores genéticos, así como el diseño de medios de selección en experimentos de transferencia genética en los que estas bacterias halófilas moderadas actúen como células receptoras de plásmidos o transposones. Por otro lado, en los últimos años, las bacterias halófilas moderadas han adquirido una gran importancia desde un punto de vista biotecnológico (Ventosa y Nieto, 1995; Ventosa y col., 1998b). Así, muchas de ellas producen exoenzimas tales como amilasas, nucleasas y proteasas de enorme interés industrial (Kamekura, 1986), y la mayoría acumula una variedad de compuestos orgánicos como solutos compatibles, que actualmente se están utilizando como estabilizadores de enzimas o células completas (Galinski y Tindall, 1992; Galinski, 1993; Ventosa y col., 1998b). Además, al ser capaces de tolerar un rango de concentraciones salinas muy amplio, son consideradas unos excelentes modelos biológicos para la elucidación de las bases moleculares de los procesos de osmorregulación en procariotas. A este respecto, debemos destacar los estudios desarrollados recientemente en nuestro laboratorio sobre los mecanismos de osmoadaptación que presenta la bacteria halófila moderada Halomonas elongata (Cánovas y col., 1996; 1997a, 1997b; 1998). El objetivo principal del presente trabajo ha sido, en primer lugar, profundizar en el conocimiento de la genética de las bacterias halófilas moderadas, con el fin de contribuir a su mejor manipulación genética, facilitando así la aplicación de las técnicas genéticas empleadas habitualmente en el laboratorio para otros tipos de bacterias. Inicialmente, nos propusimos estudiar la posible influencia de la salinidad en la susceptibilidad de un grupo representativo de bacterias Gram negativas halófilas moderadas a diferentes compuestos antimicrobianos comúnmente utilizados en estudios de transferencia genética. Con ello, se pretendió establecer los marcadores genéticos idóneos a utilizar en estudios genéticos posteriores, así como el diseño de los medios de selección adecuados. Seguidamente, y con objeto de determinar la posible utilización de diversos tipos de plásmidos como vectores de clonación en estos microorganismos, se consideró interesante analizar los mecanismos de transferencia de material genético entre bacterias halófilas moderadas, así como entre ellas y bacterias no halófilas, mecanismos hasta ahora prácticamente desconocidos. En concreto, nos hemos centrado en estudiar la posible transferencia de material genético mediante conjugación, optimizándose las condiciones en las que esta debe llevarse a cabo, y determinándose las frecuencias de transferencia y estabilidad de los diferentes plásmidos en las distintas bacterias halófilas moderadas estudiadas. Finalmente, el segundo objetivo del presente trabajo ha sido aplicar a un campo de interés actual los resultados obtenidos en la primera parte. Para ello, se ha estudiado la posible producción de enzimas extracelulares de interés industrial (amilasas, proteasas y nucleasas) por parte de un grupo representativo de bacterias halófilas moderadas. A este respecto, indicaremos que las enzimas bacterianas producidas por microorganismos extremófilos han adquirido recientemente un gran interés en Biotecnología y su Biología Molecular tiene una gran importancia en la elucidación de los mecanismos de regulación génica y de secreción de proteínas. Así, y en base a los resultados obtenidos, se ha seleccionado como objeto de este estudio la α-amilasa extracelular producida por Halomonas meridiana DSM 5425. Dicha enzima se ha caracterizado a nivel bioquímico, determinándose las condiciones óptimas de actividad, así como sus principales productos de reacción. Por último, se ha procedido a la clonación del gen responsable de su síntesis y de otros genes implicados en su expresión. CONCLUSIONES: 1. La salinidad del medio de cultivo influye en la susceptibilidad de las bacterias halófilas moderadas estudiadas a los diez agentes antimicrobianos ensayados. En general, a medida que disminuye la concentración salina del medio de cultivo, disminuye la tolerancia de este grupo de bacterias a los diferentes compuestos antimicrobianos, especialmente, a aquellos pertenecientes al grupo de los aminoglucósidos (gentamicina, kanamicina, neomicina y estreptomicina). Este hecho, posibilita la utilización de genes de resistencia a antimicrobianos como marcadores genéticos para estas bacterias. 2. La mayoría de las bacterias halófilas moderadas estudiadas son muy tolerantes a la ampicilina y muy sensibles a la rifampicina, lo que potencia el interés de estos compuestos como marcadores genéticos en estudios con este grupo de microorganismos extremófilos. La determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias a distintas salinidades de las 14 bacterias Gram negativas halófilas moderadas ensayadas frente a diez compuestos antimicrobianos permite el diseño de los medios de selección para posteriores estudios genéticos. 3. Las condiciones óptimas para la transferencia genética mediante conjugación entre Escherichia coli y las bacterias halófilas moderadas estudiadas son las siguientes: los cultivos del donador y receptor deben encontrarse en fase exponencial de crecimiento, manteniéndolos en contacto durante 16 horas, a 37º C y en el medio de cultivo SW-2, con una relación donador:receptor de 1:1; en el caso de bacterias halófilas moderadas con mayores requerimientos salinos, se debe utilizar el medio SW-5, con una relación donador:receptor de 2:1. 4. Los plásmidos de los grupos de incompatibilidad IncP e IncQ y el vector pHS15 pueden transferirse y replicarse en bacterias halófilas moderadas. Este hecho permite su utilización como vectores de clonación en estas bacterias. 5. Nuestro estudio demuestra la existencia de transferencia genética por conjugación entre bacterias halófilas moderadas cuando se utilizan medios de cultivo con un 2 a un 7,5% de sales. 6. La amilasa extracelular de Halomonas mediana DSM 5425 es una α-amilasa, que produce maltosa y maltoriosa como principales productos de su acción hidrolítica sobre el almidón. Dicha amilasa presenta una actividad óptima a 37º C, a pH 7, siendo estable a valores de pH alcalinos, y muestra una elevada tolerancia a las condiciones salinas del medio, presentando actividad hasta, incluso, un 30% de salinidad y con un óptimo al 10%. La producción máxima tiene lugar en cultivo en fase exponencial tardía o estacionaria de crecimiento, en medios con un 5% de sales, en ausencia de glucosa y en presencia de almidón y elevada oxigenación. 7. De los 12 mutantes de Halomona meridiana aislados que no poseen actividad amilasa extracelular, uno de ellos está afectado en el gen de síntesis de la amilasa y los 11 restantes, posiblemente, en un gen regulador, resultando un efecto pleiotrópico que impide la utilización de diferentes fuentes de carbono y energía. 8. La clonación del gen de síntesis de la α-amilasa de Halomonas meridiana en los vectores pML123 y pKS ha permitido su localización y orientación en un fragmento HindIII de 10,3 kb del ADN genómico. La secuencia parcial de dicho gen indica una elevada homología con otras α-amilasas bacterianas.