Microbiología y Parasitología

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Desarrollo y optimización de nuevos métodos de análisis de péptidos inmunogénicos del gluten: aplicaciones en seguridad alimentaria y en el seguimiento de la enfermedad celíaca
(2024-10-10) Segura Montero, Verónica; Sousa Martín, Carolina; Comino Montilla, Isabel María; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
El gluten es una mezcla compleja de proteínas de almacenamiento llamadas prolaminas presentes en ciertos cereales como el trigo, la cebada, el centeno, la avena y sus derivados. El gluten tiene una gran importancia en la industria alimentaria y agrícola, y un gran interés médico debido a las reacciones adversas que puede provocar en la salud. Está presente en más del 80% de los productos alimenticios manufacturados, de hecho, después del azúcar, es el ingrediente alimentario más usado en la civilización Occidental. Las enfermedades relacionadas con la ingesta de gluten engloban diferentes entidades con características epidemiológicas, clínicas y fisiopatológicas propias tales como, alergia al trigo, ataxia por gluten, dermatitis herpetiforme, sensibilidad al gluten no celíaca o enfermedad celíaca (EC). Entre estas patologías, la más conocida es esta última, que se define como un proceso sistémico que produce fundamentalmente una enteropatía crónica del intestino delgado debido a una respuesta inadecuada al gluten en pacientes predispuestos genéticamente. Actualmente, el único tratamiento disponible para los pacientes celíacos es la dieta sin gluten (DSG) durante toda la vida. De hecho, se ha demostrado que una estricta adherencia a la DSG es fundamental para eliminar los síntomas de la enfermedad, evitar deficiencias nutricionales y mejorar la calidad de vida de estos pacientes, evitando complicaciones a corto-medio plazo y reduciendo el coste socio-sanitario. No obstante, numerosos estudios han sugerido que las transgresiones de la dieta son relativamente frecuentes. Entre las principales causas de la no adherencia a la DSG se encuentran los condicionamientos de la vida social, el elevado coste de los productos dietéticos especiales o las dificultades tecnológicas para garantizar la ausencia de gluten en los alimentos manufacturados. La falta de alternativas terapéuticas para la EC subraya la necesidad de métodos analíticos sensibles y de bajo coste para medir con precisión el contenido de gluten en todo tipo de muestras, tales como, alimentos, incluidos los hidrolizados, bebidas, cosméticos y medicamentos. En Europa, el etiquetado de los productos sin gluten está regulado por el Codex Alimentarius que establece el límite ? 20 ppm para los alimentos etiquetados como sin gluten. En contraste, otras asociaciones como Gluten-Free Certification Organization (GFCO/ Norteamérica, USA) y Celiac Support Association®/United States of America, Inc. (CSA/USA, Inc.) requieren límites más bajos de ?10 y ?5 ppm de gluten, respectivamente. Por ello, resulta necesario disponer de técnicas analíticas cuya sensibilidad y especificidad aseguren de manera fiable el cumplimiento de las normativas establecidas. Los métodos de elección actualmente son los inmunológicos, no obstante, aún quedan problemas por resolver, por lo que es necesario desarrollar nuevas tecnologías para el análisis de determinados tipos de matrices como es el caso de los alimentos hidrolizados. Además, la falta de un marcador preciso para el control del cumplimiento de la dieta es todavía una cuestión sin resolver, ya que se ha demostrado que la sintomatología, serología o los cuestionarios de adherencia no son eficaces para este fin. Recientemente, se ha confirmado que el análisis cuantitativo de péptidos inmunogénicos del gluten (GIP) en muestras de heces de pacientes adultos es un método preciso y no invasivo que permite una evaluación directa del consumo del gluten después de su ingesta. Sin embargo, aún no se ha determinado la utilidad de dicho biomarcador en la población pediátrica. Además, se necesita desarrollar nuevos prototipos de determinación de GIP en orina automatizables y cuantificables para su uso en laboratorios clínicos. En base a ello, el trabajo realizado en esta Tesis Doctoral se ha centrado en el desarrollo y optimización de nuevos métodos de análisis de gluten con aplicaciones en seguridad alimentaria, y en el control de la DSG en pacientes celíacos.
Estudio del efecto del aclaramiento de la colonización por pneumocystis jirovecii en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica
(2024-04-09) Gutiérrez Rivero, Sonia; Calderón Sandubete, Enrique José; Horra Padilla, Carmen de la; Morilla Romero de la Osa, Rubén; Universidad de Sevilla. Departamento de Enfermería; Universidad de Sevilla. Departamento de Medicina; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
INTRODUCCIÓN: la elevada prevalencia de colonización por Pneumocystis jirovecii en pacientes con EPOC, y las evidencias que muestran que el hongo induce alteraciones en la respuesta inflamatoria sistémica, sugieren un posible papel en la progresión de la EPOC. El objetivo del estudio es analizar la dinámica de colonización/aclaramiento por Pneumocystis en sujetos con EPOC estable, la posible implicación en la alteración de la respuesta inflamatoria y en la evolución de la EPOC. MATERIAL Y MÉTODOS: estudio de cohortes prospectivo observacional con seguimiento durante un año. Incluimos 53 pacientes con EPOC estable que cumplieron los criterios de inclusión, se descartaron infecciones respiratorias de otra etiología. De los 53 pacientes, se obtuvieron muestras respiratorias y séricas en la visita basal y a los 4 meses; adicionalmente, se obtuvieron muestras a los 8 meses en 22 pacientes; y a los 12 meses en 14 pacientes. P. jirovecii se identificó mediante PCR del gen mtLSUrRNA en esputo espontáneo. Se cuantificaron los niveles séricos de las citoquinas IL-1β, IL-8, IL-6, TNF-α, IFN-γ y la proteína MCP-1, así como las proteínas del surfactante pulmonar A y D. RESULTADOS: El 94.4% eran hombres, con una edad media de 71 años, el 87 % eran exfumadores y el 41.5% se encontraba en estadio IV de la GOLD. En la visita basal, el 41,5% estaba colonizados por P. jirovecii. Se identificaron cuatro patrones en la dinámica de colonización: A: sujetos que aclaraban en algún punto, B: pacientes colonizados en algún punto, C: persistían negativos en dos visitas consecutivas, y D: persistían colonizados en dos visitas consecutivas. El aclaramiento se observó en 25 ocasiones y la colonización en 14. Los pacientes colonizados presentaron niveles significativamente más elevados de IL-6, IL-8 y MCP-1. CONCLUSIONES: la colonización por P. jirovecii en sujetos con EPOC es un proceso dinámico que induce alteraciones en la respuesta inflamatoria sistémica del huésped colonizado que revertiría tras el aclaramiento, sugiriendo que P. jirovecii puede contribuir a la progresión de la EPOC.
Diversidad procariota en suelos hipersalinos del Paraje Natural de las Marismas del Odiel
(2024-01-26) Galisteo Gómez, Cristina; Sánchez-Porro Álvarez, Cristina; Ventosa Ucero, Antonio; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
La presente Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio de la diversidad procariota de ambientes hipersalinos terrestres a través de dos enfoques: dependiente e independiente de cultivo. En concreto, se han estudiado suelos hipersalinos del Paraje Natural de las Marismas del Odiel (Huelva). Con esta combinación de metodologías se han contrastado las diferencias y semejanzas en la biodiversidad obtenida en dicho hábitat extremo al estudiar las mismas muestras mediante dos técnicas alternativas. Para la realización de este estudio, se han obtenido un total de 26 muestras a lo largo de tres años consecutivos. El análisis de los parámetros fisicoquímicos de dichos suelos ha puesto de manifiesto que: (i) la conductividad eléctrica indica que los suelos son salinos; (ii) la concentración de ciertos metales pesados está por encima de los límites para suelos no contaminados por dichos metales pesados. Con respecta al análisis independiente de cultivo, se han secuenciado 18 metagenomas shotgun cuyos perfiles taxonómicos muestran unas proporciones similares entre los dominios Archaea y Bacteria. Destacan los filos “Euryarchaeota”, Pseudomonadota, Bacteroidota, Gemmatimonadota y Balneolota. Este análisis ha mostrado semejanzas con otros ambientes terrestres hipersalinos, mientras que los habitantes mayoritarios en hábitats acuáticos hipersalinos no se encuentran representadas en estos ambientes terrestres. Con respecto al análisis funcional de los metagenomas, se observó una abundancia de genes relacionados con el transporte de metales pesados. Dada la elevada salinidad de las muestras, se han estudiado las estrategias de osmoadaptación, observándose que los representantes del filo de arqueas “Euryarchaeota” poseen la estrategia salt-in, mientras que la población bacteriana presenta tanto este mecanismo, como la estrategia salt-out. También se han detectado genes relacionados con la biosíntesis de los solutos compatibles. A partir de los metagenomas se han reconstruido > 4.000 bins, de los cuales tan solo 11 poseen una calidad alta. Dada la elevada calidad de los parámetros genómicos de este grupo y el hecho de que muchos de ellos tan solo se puedan clasificar taxonómicamente a nivel de filo, indica que nos encontramos ante genomas de taxones no descritos. En segundo lugar, se han estudiado 14 muestras mediante técnicas dependientes de cultivo utilizando distintas condiciones y medios de cultivo. En total, se han aislado unas 4.000 cepas, de las que se han identificado 549 cepas, asignándose a los filos Actinomycetota, Balneolota y Pseudomonadota y “Euryarchaeota”, los cuales se corresponden con los identificados mediante metagenómica. No obstante, Bacillota fue el segundo filo con mayor número de aislados, mientras que en los metagenomas se encontraba como un grupo minoritario. Los porcentajes de identidad de 60 de dichas cepas indicaban que podrían constituir nuevos taxones. Algunas se han seleccionado para un estudio detallado, describiéndose cuatro especies y un género nuevos, Terrihalobacillus insolitus gen. nov., sp. nov., Pseudidiomarina terrestris sp. nov., Aquibacillus salsiterrae sp. nov. y Fodinibius salsisoli sp. nov., y se han reclasificado las especies del género Aliifodinibius dentro de Fodinibius. Por otro lado, se ha anotado la presencia de rutas de biosíntesis de vitaminas, así como mecanismos de adaptación a los metales pesados y la elevada salinidad. El análisis de la distribución ecológica de los nuevos taxones, excepto Fodinibius, indica que se trata de microbiota minoritaria en los ambientes hipersalinos. En definitiva, la diversidad procariota presente en los suelos hipersalinos del Paraje Natural de las Marismas del Odiel es tan variada que es necesario utilizar conjuntamente las técnicas dependientes e independientes de cultivo. Asimismo, nuestro estudio muestra que muchos de los taxones que habitan estos ambientes extremos no se han descrito anteriormente, y que algunos presentan funciones de gran relevancia.
Desarrollo y validación de métodos inmunológicos para la estimación del gluten consumido y sus aplicaciones en la enfermedad celiaca
(2023-12-04) Mendia Azkoaga, Irati; Cebolla Ramírez, Ángel; Sousa Martín, Carolina; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
La enfermedad celiaca (EC), se define como una enteropatía inflamatoria crónica del intestino delgado causada por la ingesta de gluten en individuos genéticamente predispuestos. Por tanto, es el resultado de la interacción del gluten con factores inmunológicos, genéticos y ambientales. Afecta aproximadamente al 1,4% de la población, aunque su prevalencia puede variar en función de la edad, el continente y la región. Esta patología está infradiagnosticada a nivel mundial ya que los criterios utilizados en los diferentes estudios epidemiológicos para su diagnóstico no son uniformes, así por ejemplo el estudio serológico, en adultos, requiere confirmación histológica. Las proteínas del gluten están presentes en el trigo, la cebada, el centeno la avena y sus derivados, y se degradan de forma deficiente en el tracto gastrointestinal ya que son resistentes a las enzimas digestivas. Tras la ingestión de alimentos con gluten se generan péptidos inmunogénicos que son capaces de producir daño en la mucosa intestinal con una lesión que se caracterizada histológicamente por infiltrado de linfocitos intraepiteliales e hiperplasia de las criptas con distintos grados de atrofia de las vellosidades intestinales, El cuadro clínico de la EC es heterogéneo, presenta una gran variedad de síntomas que pueden ser tanto gastrointestinales como extraintestinales, y que difieren considerablemente en función de la edad de presentación. La actual forma recomendada para el diagnóstico de la EC se basa en un flujo de pruebas, donde las primeras suelen ser las serológicas. No obstante, estas pruebas de diagnóstico sólo son válidas para detectar la enfermedad en aquellas personas que consumen gluten de forma regular y sin restricción en su dieta. Una vez efectuado el diagnóstico, la única terapia disponible es la adhesión a una dieta sin gluten (DSG) de por vida. No obstante, la completa exclusión del gluten de la dieta es complejo y las transgresiones dietéticas, tanto voluntarias como involuntarias, son frecuentes. Por ello, una monitorización continua del paciente para asegurar una correcta adherencia a la DSG resulta necesaria. Para la monitorización clínica de esta patología las guías clínicas recomiendan que en la práctica clínica se realicen de forma periódica pruebas serológicas, estudios de la sintomatología, cuestionarios dietéticos y biopsias intestinales. Sin embargo, se ha demostrado que estas herramientas son poco eficientes, invasivas o inexactas para evaluar la adherencia a la DSG. Por lo que contar con herramientas fiables para la monitorización de la DSG de forma eficiente y no invasiva es vital. En los años 2012 y 2017 se publicaron unos estudios con los que se abría la posibilidad de utilizar la determinación de los péptidos inmunogénicos del gluten (GIP) en heces y orina, respectivamente, como marcadores directos de la ingesta de gluten, ya que permiten monitorizar la adherencia a la DSG en pacientes con EC. La recuperación de cantidades medibles de GIP en estas excreciones corporales indica de forma directa que el gluten ha pasado por el tracto digestivo y, que, por lo tanto, es al menos parcialmente resistente a la digestión gastrointestinal humana, además de que puede absorberse y acceder al torrente sanguíneo. Estas herramientas de diagnóstico o seguimiento requieren para su amplia aplicación en la rutina clínica en la Unión Europea del marcado IVD (Diagnostico In Vitro) y CE (Conformidad Europea). En este contexto, esta tesis doctoral se ha centrado en el desarrollo y validación de nuevas metodologías analíticas en ELISA e inmunoensayos de flujo lateral con soluciones alternativas para facilitar el diagnóstico de la EC y la detección de la ingesta de gluten, así como el alcance de sus aplicaciones. El Capítulo 1 es una introducción general sobre los trastornos relacionados con el consumo de gluten, con especial atención a la EC, y sobre inmunoensayos para la detección del gluten y GIP detallando además los factores a tener en cuenta durante el desarrollo y la validación de los mismos. En el Capítulo 2 se exponen los antecedentes del tema y los objetivos principales de esta Tesis Doctoral. El Capítulo 3 incluye la validación del iVYCHECK GIP Urine, un IEFL de uso en el seguimiento de la DSG mediante la detección de los GIP para su conformidad con el reglamento 746/2017 con el objetivo de poder obtener el marcado CE IVD. En el Capítulo 4 se demuestra la utilidad clínica en atención primaria del CeliacDetect, un IEFL para la detección de anti-tTG-IgA en sangre, para la detección precoz de la EC mediante cribado en población pediátrica, y explorar, la conveniencia de monitorizar el consumo de gluten reciente para hacer más eficaces dichos diagnósticos. El Capítulo 5 describe el desarrollo de un método ELISA para la detección de GIP en orina y sus aplicaciones durante el diagnóstico y seguimiento de la EC. Por último, en el Capítulo 6, contiene las conclusiones alcanzadas en esta Tesis Doctoral.
Inhibición de la actividad ATPasa del complejo SWI/SNF: cambios cromatínicos y de la expresión génica
(2023-06-12) Basurto Cayuela, Laura; García Domínguez, Mario; Reyes Rosa, José Carlos; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
Los complejos SWI/SNF fueron la primera maquinaria de remodelación de cromatina dependiente de ATP descubierta y están compuestos por 11-15 proteínas diferentes en mamíferos. Su actividad enzimática la llevan a cabo dos ATPasas mutuamente excluyentes, denominadas BRM (SMARCA2) y BRG1 (SMARCA4). Recientemente se ha desarrollado una nueva molécula que inhibe la actividad de BRG1 y BRM, denominada BRM014, y que, por lo tanto, inhibe a todos los complejos SWI/SNF. Sorprendentemente, este inhibidor solo afecta la expresión de aproximadamente el 10% de los genes expresados en la línea no cancerosa de epitelio mamario de ratón NMuMG. Hemos investigado las características estructurales y transcripcionales, así como el entorno cromatínico de los genes dependientes e independientes de SWI/SNF. Se ha mostrado que la accesibilidad del 90% de los promotores de genes activos de la línea NMuMG no se ve afectada tras el tratamiento con BRM014, mientras que aproximadamente el 56% de otros elementos regulatorios distales en cis si cambian. Describimos que en ausencia de la actividad SWI/SNF ocurre una fuerte ocupación nucleosomal de elementos regulatorios con claras características de enhancers. En un pequeño grupo de promotores la inhibición de SWI/SNF provoca un uso alternativo de inicios de la transcripción y un aumento de la transcripción antisentido a partir de promotores. Por otro lado, nuestros datos no muestran un defecto general en la eficiencia de splicing en ausencia de de la actividad SWI/SNF. Finalmente, observamos que, BRM014 afecta el nivel basal de expresión de genes relacionados con la transición de epitelio a mesénquima (EMT) y las vías de transducción de señales RAS. Además, BRM014 afecta fuertemente la inducción dependiente de TGFβ de la EMT, proceso implicado en la formación de metástasis.
Desarrollo y uso de herramientas útiles en el manejo de la enfermedad celiaca y complicaciones asociadas
(2022-12-22) Sánchez Muñoz, Diego; Moreno Amador, María de Lourdes; Sousa Martín, Carolina; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
La Enfermedad Celiaca (EC) es una patología crónica inflamatoria con afectación del intestino delgado provocada por la ingesta de gluten en personas genéticamente predispuestas. El único tratamiento disponible en la actualidad es el seguimiento de una dieta sin gluten (DSG) durante toda la vida. Se ha demostrado que una adherencia estricta a la DSG es fundamental para eliminar los síntomas de la enfermedad, evitar deficiencias nutricionales, recuperar la mucosa intestinal y mejorar la calidad de vida (CV) de estos pacientes. Una proporción relativamente baja de pacientes con EC presentan lo que se conoce como Enfermedad Celiaca No Respondedora (ECNR) que cursa con síntomas y atrofia vellositaria duodenal a pesar de realizar una dieta exenta de gluten. Entre las causas de la ECNR se ha descrito la exposición al gluten, el síndrome de intestino irritable, la Enfermedad Celíaca Refractaria (ECR), la intolerancia a la lactosa y la colitis microscópica, así como el sobrecrecimiento bacteriano intestinal, la insuficiencia pancreática y la intolerancia a la fructosa. De todas estas causas, la que peor pronóstico y evolución tiene es la ECR que se define como una enteropatía grave persistente con malabsorción sintomática, tras el seguimiento de una DSG estricta, y que requiere el tratamiento con corticoides e inmunosupresores, entre otros. Por tanto, el correcto diagnóstico de la ECR se convierte en un paradigma fundamental en los pacientes con EC. El seguimiento nutricional, serológico y anatomopatológico forma parte de las directrices para el diagnóstico de la ECR, sin embargo, las metodologías existentes para la evaluación del seguimiento nutricional de la DSG son subjetivas, y no detectan de forma directa el gluten consumido. La determinación de los péptidos inmunogénicos de gluten (GIP) en muestras de heces y orina es una herramienta sensible, específica y objetiva y no invasiva para la verificación del estricto cumplimiento de la DSG en los pacientes con EC en comparación con la serología, los cuestionarios dietéticos, la sintomatología y la biopsia intestinal, que carecen de al menos de una de estas propiedades. Por tanto, la determinación de GIP podría ayudar también al seguimiento de la DSG en pacientes con ECNR y ECR, contribuyendo al mejor cumplimiento de esta, y al cambio en el pronóstico de la evolución de la EC. Es indudable el impacto negativo que tiene la EC, al igual que otras enfermedades crónicas, en la CV de estos pacientes, no solo por la patología en sí, sino también por la necesidad de la adherencia a la DSG y las connotaciones sociales, físicas, psicológicas y económicas que ello conlleva. La medición de la CV se convierte así en un elemento prioritario para la evaluación de las áreas que afectan al paciente y así emprender acciones que reduzcan el impacto en su CV. Los cuestionarios genéricos son imprecisos ya que no tienen en cuenta las connotaciones especiales de esta enfermedad, y por ello son necesarias herramientas y cuestionarios específicos para la EC. Resulta incuestionable la necesidad además de la adaptación cultural e idiomática y, asimismo, la adaptación según el grupo de edad del paciente. Actualmente, existen cuestionarios diferenciados orientados a la población pediátrica y adultos, pero no hay herramientas específicas que evalúen la CV en pacientes con EC en la etapa adolescente. El trabajo realizado en esta Tesis Doctoral se ha centrado, en primer lugar, en el uso de la metodología de detección de GIP en orina para evaluar la adherencia real a la DSG de los pacientes con ECR como parte estratégica del diagnóstico. En segundo lugar, se ha desarrollado un cuestionario en español específico de la CV para la EC mediante la traducción, adaptación cultural y validación del “Celiac Disease Questionnaire (CDQ)”. Se ha evaluado la CV mediante este cuestionario en pacientes celiacos tanto adultos como en adolescentes en España con el objetivo de detectar áreas afectadas, y establecer diferencias de necesidades entre subgrupos. El Capítulo 1 es una introducción general sobre la EC y la ECR. El Capítulo 2 comprende una revisión actualizada sobre los avances más relevantes en la fisiopatología, el diagnóstico, manejo clínico de la EC, y de otras patologías relacionadas con el gluten, así como de la educación nutricional de los pacientes que padecen esta patología. En el Capítulo 3 se exponen los antecedentes del tema y los objetivos principales de esta Tesis Doctoral. En el Capítulo 4 se ha evaluado la determinación de GIP en orina de pacientes catalogados con ECR como metodología para el seguimiento de la adherencia a la DSG, y se ha establecido un algoritmo en el diagnóstico de la ECR para diferenciar los pacientes que son verdaderos refractarios de los “expuestos al gluten”. En el Capítulo 5 se ha diseñado un cuestionario CDQ en español mediante la traducción, adaptación cultural y validación del cuestionario francés de referencia, y se ha evaluado la CV de los pacientes españoles con EC tanto adultos como adolescentes, identificando las áreas más afectadas, así como las diferencias entre los grupos poblacionales para abordar acciones que reduzcan el impacto de la DSG. En el Capítulo 6 se resumen y discuten los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral, abordando la aplicación clínica de la detección de GIP en orina para el seguimiento de la DSG en pacientes con ECR, y evaluando la utilidad de los cuestionarios específicos de CV de la EC para identificar las áreas más comprometidas en diferentes grupos poblacionales de celiacos. Por último, en el Capítulo 7, se incluyen las conclusiones alcanzadas en esta Tesis Doctoral.
Control de la adherencia a la dieta sin gluten mediante la detección de péptidos inmunogénicos de gluten (GIP) en orina: concordancia con el daño histológico en mucosa duodenal de pacientes con enfermedad celiaca
(2021-09-23) Garzón Benavides, Marta; Pizarro Moreno, Ángeles; Sousa Martín, Carolina; Universidad de Sevilla. Departamento de Medicina; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
Estudio de los metalorreguladores Fur en la bacteria extremófila Chromohalobacter salexigens: implicación en la homeostasis del hierro y en la síntesis de ectoínas
(2021-09-10) Naranjo Fernández, Emilia; Argandoña Bertrán, Montserrat; Vargas Macías, Carmen; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
Chromohalobacter salexigens es un microorganismo extremófilo modelo de máximo interés y aplicabilidad en Biotecnología Microbiana, ya que sintetiza en respuesta a estrés osmótico y/o por temperatura, los solutos compatibles ectoína e hidroxiectoína, compuestos con propiedades estabilizadoras por lo que son de gran interés en Dermofarmacia, Biología Molecular, Agricultura o Biomedicina. La síntesis de ectoínas y su regulación es un proceso en el que intervienen complejos mecanismos transcripcionales y postranscripcionales, además de la implicación de reguladores globales y específicos. Por otro lado, se ha puesto de manifiesto la importancia de la regulación de la homeostasis del hierro en la adaptación a la salinidad, y por tanto en la síntesis de estos solutos. Así, el regulador global Fur es el encargado de mantener un control preciso de los niveles de hierro intracelulares existiendo, en C. salexigens, dos parálogos pertenecientes a la superfamilia Fur, Fur1 y Fur2. Además, para poder sintetizar la cantidad necesaria de estos solutos en condiciones de estrés, en C. salexigens se produce una adaptación metabólica en función de la salinidad y temperatura, ya que la síntesis de ectoínas depende de intermediarios procedentes de rutas del metabolismo central. Así, para poder dilucidar posibles modificaciones genéticas que permitan la obtención de cepas mejoradas en la producción de estos compuestos, se hace necesario un estudio más global e integrado tanto del metabolismo, como de los reguladores implicados en dicho proceso, así como de otros factores ambientales que puedan intervenir. En los últimos años se ha desarrollado un modelo metabólico de C. salexigens a escala genómica, que permitirá la predicción de estrategias de Ingeniería Metabólica para optimizar la producción de ectoínas en este microorganismo. Para la mejora de este modelo se está desarrollando un modelo de regulación que integre tanto las redes de señalización como las redes transcripcionales responsables de la adaptación metabólica y de la síntesis de ectoínas. Para ello se hace necesario el estudio, tanto a nivel molecular como global, de reguladores clave, como son los metalorreguladores Fur. En este trabajo se ha profundizado en el estudio sobre la homeostasis del hierro y su relación con la salinidad y temperatura, así como de su regulación, poniendo de manifiesto la importancia del hierro en la osmo- y termoadaptacion, y, por tanto, en la acumulación de solutos compatibles en C. salexigens. Además, se profundizado en la caracterización molecular de los dos metalorreguladores globales de la familia Fur, Fur1 y Fur2. Nuestro estudio ha demostrado que ambos están implicados en la regulación de la homeostasis del hierro, en función de salinidad y temperatura, así como en la osmo y termoadaptación, mediante el control transcripcional de la síntesis de ectoínas, pudiendo actuar tanto como activadores o inhibidores según la salinidad, temperatura y concentración de hierro extracelular. Esta conexión entre la homeostasis del hierro, la adaptación a elevada temperatura y la síntesis de solutos compatibles, es de especial relevancia, ya que se ha descrito en muy pocos organismos. En relación a su influencia a nivel global, experimentos de RNAseq en diferentes condiciones de salinidad, muestran que la eliminación tanto de fur1 como de fur2 afectó a la expresión del 40% de los genes, tanto a baja como a elevada salinidad, todos ellos pertenecientes a distintas categorías funcionales COG, mostrando el gran impacto sobre la fisiología de C. salexigens de ambos reguladores Fur. Entre los genes afectados, destacan los más de 50 genes que codifican reguladores transcripcionales, entre ellos algunos factores Sigma, sugiriendo que tanto Fur1 como Fur2 son reguladores globales, pero además sugiere su posición en un nivel superior dentro de la jerarquía de regulación, lo que explicaría el elevado número de genes que se ven afectados en su expresión. Por otro lado, uno de los aspectos más destacados que revelaron los estudios de RNAseq fue la implicación de los reguladores Fur en el metabolismo central. Así los genes relacionados con la respuesta metabólica controlados por el regulador Fur1 fueron 278 genes a baja salinidad y 255 genes a elevada salinidad, mientras que en relación al regulador Fur2, se observaron 254 genes diferencialmente expresados a baja salinidad, frente a los 187 genes a elevada salinidad. Las rutas donde se concentraron el mayor número de genes afectados fueron aquellas relacionadas con el metabolismo energético, el metabolismo de aminoácidos y el metabolismo de carbohidratos. Además, se ha observado que ambos reguladores también intervienen de forma importante en el control de procesos de transporte y metabolismo del hierro y zinc en función de las condiciones de salinidad, así como en la osmoadaptación, ya que parece que ambos reguladores intervienen no sólo en la síntesis, sino también en el transporte y degradación de los principales solutos compatibles, entre ellos las ectoínas. Por todo ello, los reguladores Fur1 y Fur2 se pueden postular como reguladores globales de la bacteria C. salexigens, implicados no solo en el control del metabolismo de las ectoínas, sino también en la adaptación metabólica y fisiológica de dicha bacteria a la osmolaridad del medio.
Aplicación de técnicas microbiológicas y químicas para la recuperación de suelos contaminados por plaguicidas e hidrocarburos aromáticos policíclicos. Evaluación de su viabilidad mediante estudios de biología molecular y ecotoxicidad
(2021-04-27) Lara Moreno, Alba; Merchán Ignacio, Francisco; Villaverde Capellán, Jaime; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
En la actualidad existe un interés creciente por los métodos de recuperación biológicos de suelos contaminados, presentándose la biorrecuperación como una alternativa a los métodos convencionales (landfilling, incineración o descomposición química). Se trata de una herramienta respetuosa con el medio ambiente, de bajo coste y no invasiva, que utiliza organismos vivos para detoxificar las sustancias de riesgo para el hombre y el medio ambiente. Por este motivo, en este estudio para conseguir la recuperación de suelos contaminados se han llevado a cabo ensayos de biodegradación y mineralización en medio acuoso, en suspensiones suelo-agua y en suelo. Los contaminantes orgánicos estudiados en este trabajo fueron: cinco herbicidas pertenecientes a la familia química de las fenilureas (diurón, linurón, isoproturón, clortolurón y fluometurón), otro herbicida de la familia de las dinitroanilinas (trifluralina), un insecticida organofosforado (clorpirifós), así como hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) de bajo y alto peso molecular. Cuando la biodegradación no se puede llevar a cabo de forma natural debido a que los microorganismos no disponen de los nutrientes esenciales para ello en la zona contaminada, o no presentan las herramientas metabólicas necesarias para actuar sobre un determinado contaminante, se requiere de la intervención mediante actuaciones encaminadas a fomentar la actividad microbiológica, siendo necesario recurrir a la biodegradación asistida a través del empleo de dos posibles técnicas: bioestímulo (mediante la adición de nutrientes) y bioaumento (inoculando microorganismos de origen endógeno y/o exógeno). Los macro y micronutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano suelen estar presentes en el suelo en cantidades demasiado bajas, provocando una limitación para la actividad microbiana, de ahí la necesidad de emplear una solución de nutrientes que actúe como estimulante de los microorganismos degradadores presentes en el suelo. Los microrganismos usados como degradadores específicos se obtienen mediante cultivos de enriquecimiento de suelos que han estado en contacto con el contaminante durante un largo periodo de tiempo. La microbiota del suelo se expone a una elevada concentración de contaminante, facilitando de esta forma el crecimiento de aquellos microorganismos que presentan la capacidad de usar como fuente de carbono y energía al contaminante orgánico en cuestión. Los procesos de recuperación de suelos contaminados por compuestos orgánicos como plaguicidas y PAHs están a menudo muy limitados a consecuencia de sus propiedades físicoquímicas, baja solubilidad, elevado kow y koc, estructura aromática, grupos halogenados, etc. Estas propiedades hacen que la fracción biodisponible del contaminante en el suelo sea muy baja y, por lo tanto, sean sustancias recalcitrantes mostrando una elevada persistencia. Con el fin de mejorarla, en el presente estudio se han empleado ciclodextrinas, oligosacáridos cíclicos que, gracias a su capacidad para formar complejos de inclusión con compuestos orgánicos hidrofóbicos, son capaces de incrementar su solubilidad en agua y en consecuencia su biodisponibilidad. El descenso de la concentración inicial del contaminante no implica la no formación y acumulación de metabolitos tóxicos, lo que haría replantear la aplicación o no de una determinada técnica de biorrecuperación. Por lo que, ensayos de ecotoxicidad han sido realizados al inicio y al final de los tratamientos aplicados en el presente trabajo, mediante la monitorización de la bioluminiscencia natural de la bacteria Vibrio fisheri (Microtox®), con el fin de evaluar la eficacia y seguridad de la estrategia de descontaminación empleada y por lo tanto su viabilidad. Los estudios de biología molecular llevados a cabo han ayudado igualmente, a evaluar la viabilidad de las técnicas de biorrecuperación empleadas. Gracias al empleo de distintas técnicas de biología molecular se ha conseguido, por un lado, identificar las cepas bacterianas aisladas y seleccionadas como degradadoras de los distintos contaminantes orgánicos estudiados mediante la secuenciación del ARN ribosómico 16S, y por otro lado, secuenciar el genoma de la cepa bacteriana seleccionada y describir la ruta de degradación de fenantreno que utiliza, gracias a la identificación de los metabolitos formados y de los genes que codifican las enzimas responsables de llevar a cabo la ruta de degradación, mediante una amplia búsqueda bibliográfica y un análisis exhaustivo de la anotación del genoma bacteriano empleando diversas bases de datos. Para la confirmación de la presencia de estos genes degradadores en el genoma bacteriano, se emplearon herramientas bioinformáticas (BLAST, Clustal Omega, etc.) que nos permitieron alinear la secuencia del gen con el genoma de la cepa bacteriana estudiada (Stenotrophomonas maltophilia CPHE1), confirmando la posibilidad de la presencia de dicho gen en la bacteria de estudio. Por último, una vez identificados los genes implicados, se estudió su expresión empleando la Reacción en Cadena de la Polimerasa Reversa (RT-PCR), confirmando así la posible ruta de degradación propuesta.
Análisis de comunidades microbianas presentes en la cueva de Doña Trinidad (Ardales, Málaga) utilizando cultivos y métodos moleculares basados en ADN y ARN
(2008-10-06) Stomeo, Francesca; González Grau, Juan Miguel; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
Microorganisms constitute an extremely heterogeneous group of organisms on our planet and microbial communities generally show an extraordinary potential of metabolic capacities (Brock and Madigan, 2000). However, only a small number of microorganisms are known and have been properly described, since only an extremely low portion of microorganisms can be cultivated through traditional microbiological techniques (Curtis et al., 2002). Thanks to the development of new molecular methods it is now possible to identify previously undetected microorganisms considered uncultivable in the laboratory. Historical Cultural Heritage sites often offer an adequate scenario for the growth of microorganisms, which can thus cause damage, sometimes irreversible, to the artistic representations. In particular, underground environments such as caves and catacombs, in which the temperature is relatively constant throughout the year and the humidity generally high, offer a favourable habitat for the growth of numerous microorganisms (Agarossi, 1992). The present study is part of a multidisciplinary project focused on the conservation of the works of art of Ardales’s Cave and represents the first microbiological study in this cave. The Cave of Doña Trinidad is located in the town of Ardales, Malaga (Spain). The cave has a length of 1.5 km with several halls and galleries. The interior contains labyrinths of columns, underground lakes, and beautiful formations of stalactites and stalagmites. The cave contains paintings and engravings dating back to about 20,000 years, belonging to the Upper Paleolithic. The samples analyzed were collected from the cave’s soil and from the main artistic representations (engraving of a fish, serpents, red pigments and black tracks from the cave). In particular, the microbial composition of white colonizations present in the cave was studied. In recent years, those colonizations have spread abundantly throughout the cave. Results showed a dominance of Proteobacteria in the studied samples except in white colonizations. Among the metabolically active communities of the cave, Gammaproteobacteria and Alphaproteobacteria were the most abundant in soil samples, engravings, red pigments and black tracks. Firmicutes, Bacteroidetes, Deinococci, Chloroflexi, Planctomycetes and Nitrospirae were present at lower proportions (as revealed by DNA-based molecular methods) while Acidobacteria and Sulphate reducing bacteria showed high diversity. The analysis of the bacterial communities of the white colonizations showed significant differences with respect to the other studied samples. The Actinobacteria phylum and in particular the genus Pseudonocardia, was the most metabolically active component of these colonizations as a result of DNA and RNA libraries. Molecular fingerprints of the metabolically active microbial communities also showed a major, almost exclusive, band corresponding to sequences belonging to the genus Pseudonocardia showing that Pseudonocardia played a key role in white colonizations’ expansion in Ardales’s Cave (Stomeo et. al., 2007). Considering these results and the important role played by Pseudonocardia in the cave, we tried to cultivate this bacterium in the laboratory. We obtained three strains of this genus and they were used to carry out enzymatic and metabolic studies. To investigate the metabolism of Pseudonocardia and the best conditions for its growth we carried out colonization’s experiments (in the laboratory) with the isolated strains using cave’s soil as substrate, with and without the addition of different nutrients (carbon, nitrogen and phosphate), at 16 ºC (cave’s temperature) and at 28ºC. The results indicated that Pseudonocardia grows better in the presence of glucose and phosphate with a significant statistical value (P<0.05) with respect to others nutrients showing that this bacterium’s proliferation is maintained by the cave’s temperature and its development is favoured by organic nutrients and phosphate’s sources which might being limiting Pseudonocardia’s growth in situ. Rarefaction curves of bacterial phyla detected in this study through molecular methods indicated that, even if a higher number of clones were analyzed it would not have been possible to detect additional bacterial phyla; the OTUs curves suggested the presence of an elevated bacterial diversity in the cave under study. In the case of isolated strains, OTUs rarefaction curves indicated that, culture techniques only allowed the detection of a reduced fraction of microorganisms in the cave because an asymptote was reached well below the curve obtained by culture-independent methods based on DNA, cloning and sequencing. With regard to the fungal diversity in Ardales’ Cave, the results indicated the presence of Ascomycota and Basidiomycota. The most frequent orders in the cave were Hypocreales and Eurotiales (Ascomycota) and Tremellales among Basidiomycota. Fusarium (Hypocreales) was the unique fungal genus detected through DNA libraries. This suggested its high presence in the cave and that its spread by spores’ production could seriously deteriorate Ardales’ Cave paintings and engravings. As for Pseudonocardia, this fungus was isolated in the laboratory and colonization assays were performed. The results obtained indicated that this fungus’s growth is favored at 28 °C and in the presence of nitrogen sources (p <0.05). Rarefaction curves showed that during this study, it was possible to detect an extremely significant portion of fungal species present in the cave of Doña Trinidad. Results obtained during this study have led to the following general conclusions: - Proteobacteria represented the most characteristic phylum in the analyzed samples with the exception of white colonizations. Gammaproteobacteria and Alphaproteobacteria represented the main classes showing metabolic activity in the studied samples. - Other bacterial phyla revealed during this study are: Acidobacteria, Sulphate reducing Bacteria, Chloroflexi, Planctomycetes, Deinococci, Nitrospirae and Bacteroidetes. The role these phyla play in the cave is unknown, since their metabolism and physiology are not yet well understood. - White colonizations present in the cave were composed mainly by Actinobacteria, in particular by the genus Pseudonocardia. - The presence of fungal species was detected in the Cave of Doña Trinidad. Among these, the orders Hypocreales, Eurotiales (Ascomycota) and Tremellales (Basidiomycota). Fusarium (Hypocreales) was the most abundant fungal genus detected in the cave during this study. - Molecular methods based on DNA were useful to identify the bacterial and fungal members of the microbial communities in the studied cave. Molecular techniques based on RNA allowed the identification of those bacteria metabolically active in the analyzed communities. - The combination of standard culture techniques and molecular methods is essential for fungal classification. - Through this study it was possible to determine the majority of bacterial and fungal components of the microbial communities of Doña Trinidad Cave. Among these, Pseudonocardia (Bacteria) and Fusarium (Fungi) represented the major risks for the cave’s conservation. - The cultivation of bacteria and fungi allowed the study of the strains’ capability to grow under different conditions. - In order to reduce the proliferation of Pseudonocardia throughout the cave, it would be necessary to limit the amount of organic material and phosphate in the cave. - With regard to Fusarium, it would be necessary to maintain stable the temperature in the cave and limit nitrogen’s sources, in order to reduce the possibility of proliferation of this fungal species.
Redes de señalización implicadas en la regulación del metabolismo de las ectoínas en la bacteria halófila Chromohalobacter salexigens y su potencial terapéutico como agente neuroprotector
(2020-07-21) García Valero, Rosa María; Argandoña Bertrán, Montserrat; Vargas Macías, Carmen; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
Chromohalobacter salexigens is a halophilic bacterium which naturally produces ectoine and hydroxyectoine, two biotechnologically important compatible solutes that are accumulated in response to osmotic and heat stress, respectively. The exploitation of C. salexigens in biotechnology as a producer of ectoines requires an integral understanding of the regulatory pathways controlling ectoines metabolism. The availability of its genomic sequence, physiological, biochemical, genetic, and high performance transcriptomics data, previously obtained from our Research Group, together with regulatory studies (this work), will allow us to obtain a more global knowledge of the metabolism of the ectoines in C. salexigens. The aim of this PhD was two-fold. On the one hand, to gain insight on the regulatory circuits controlling the metabolism of ectoines in C. salexigens. On the other, to progress in the biomedical use of ectoine for the prevention and treatment of neurodegenerative diseases. The findings presented in this work provide clues for a better understanding of the complex regulation of ectoine metabolism and osmoadaptation in this moderately halophilic bacterium, and its contribution to adaptation to extreme environments. Our results will be overlayed on the existing high-quality genome-based metabolic model and global analyzes, in order to facilitate the rational design of new strains for Systems metabolic engineering. Additionally, we have investigated the in vitro and in vivo application of ectoine as neuroprotective- and inflammation-preventive- treatment in an Aβ murine model of Alzheimer's disease. Thus, we have got more insight in its potential applications in biomedicine, especially in neurodegenerative disorders as Alzheimer’s disease (AD). EupR is the first-described response regulator of a two-component system involved in bacterial osmoregulation (Rodríguez-Moya et al., 2010). Through in silico studies, EupK was selected as its putative cognate histidine kinase. Phenotypic analyses of eupR and eupK mutants showed that both, EupR and EupK, participate in the control of the three processes within the metabolism of ectoines, synthesis, degradation/recycling and uptake, as a key system that allows the fine adjustment of the intracellular concentration of these solutes. Nevertheless, the association between EupK and EupR could not be confirmed by these analyses, as eupK did not always reproduce the eupR phenotype. This finding pointed out to the involvement of additional HKs and/or RR that would participate in the control of ectoines metabolism. Additional in vivo protein-protein interaction and phosphotransfer experiments, demonstrated not only the interaction between EupK and EupR, but also the functionality of the two component system, as EupK was able to phosphorylate EupR. As EupK is a hybrid HK that lacks the HPt domain involved in phosphotransfer during phosphorelay events, three hybrid HKs, Csal_1062, Csal_1635 and Csal_2667, were selected as the most suitable candidates to form part of the EupK/EupR signalling network by providing this phosphotransfer domain. Our results indicate that EupK and EupR constitute a two-component system, which form part of a "many to one"-type complex signaling network with the other hybrid HKs, where EupR is phosphorylated by all of them. These cross-talk events within the response regulator could be developed either by a direct phosphorylation of the REC domain of EupR by the HisKA domains of the hybrid histidine kinases, or through a phosphorelay mechanism involving additional HPt domains, and could depend on the environmental conditions. Besides, this branched and/or crossed regulation circuit would be able to detect and respond to both salinity and extracellular ectoine stimuli. Furthermore, transcriptomic experiments revealed that the elimination of eupR affected more than 18 and 22% of C. salexigens genes at low and high salinity respectively, distributed throughout the different functional categories described by COG. This result suggested that EupR has a global impact on C. salexigens physiology. Among them, 20 transcriptional regulators were differentially expressed in the mutant, strongly suggesting that EupR is a regulator of regulators, and explaining the large number of genes affected by its deletion. The importance of this regulator should be highlighted in the so-called "nitrogen channeling" that occurs in C. salexigens (Pastor et al., 2013), by controlling the balance between protein synthesis, nitrogen metabolism and ectoine synthesis, possibly through the global nitrogen regulator NtrC, among others. Another of the processes controlled by this regulator would be chemotaxis, which should be directly related to osmodetection in C. salexigens, as flagellum motility is Na+-dependent (Salvador et al., 2018). This regulatory mechanism might be exerted through the control of other two-component systems such as CheA and CheY. On the other hand, the implication of EupR in central metabolism was remarkable, with 212 and 306 genes differentially expressed at low and high salinity, respectively. Among them, we should highlight those involved in carbon metabolism, by influencing the different metabolic flows distribution balance: (i) glucose assimilation by regulating the Entner-Doudoroff (ED) periplasmic and cytoplasmic route; (ii) nitrogen metabolism and (iii) the energetic metabolism through the control of oxidative phosphorylation, especially at high salinity. Finally, the results revealed a strong influence of EupR on C. salexigens osmoadaptation, where EupR could have a role in regulating the hierarchical accumulation of compatible solutes, in order to ensure the appropriate intracellular concentration of the different solutes according to the environmental constraints, the carbon source, or the presence of osmoprotectants in the external medium, among others. A final conclusion is that EupR would meet all the criteria to be postulated as a global regulator involved in the control of the metabolism of compatible solutes, especially that of ectoines, as well as the energy producing processes and central metabolism of C. salexigens. Hence, it would influence the C. salexigens metabolic and physiological adaptations to the external osmolarity. The results arising from this work will contribute to elucidate the complex regulatory network involved in the control of ectoine synthesis, which in turn will allow the construction of a signaling and transcriptional regulatory model for C. salexigens. On the other hand, the in vitro and in vivo neuroprotective capacity of ectoine was evaluated in this work. Our results demonstrate the ectoine’s protective capacity against the oxidative damage, its antioxidant activity in human neuronal cells, as well as its capacity to prevent the formation of ADDL oligomers responsible for inflammation. In addition, ectoine was able to cross the blood-brain barrier and reach cerebral areas where Alzheimer diseased is developed, as cortex or hippocampus, and to remain with pharmacologically active concentrations during 48h. Intragastric administration of ectoine during 3 months in young transgenic APP/PS1 mice (which develop AD), improved their memory and diminished Aβ concentration in brain tissue. A decrease in plaques size accompanied by an increased recruitment of the microglia was also observed. Additionally, ectoine intragastric inoculation led to similar concentrations in brains that those achieved upon intraperitoneal administration, within the range of activity observed in vitro, suggesting that oral administration of ectoine would be feasible. All these results pointed to ectoine as an interesting candidate to be used as a drug for the prevention and treatment of neurodegenerative diseases.
Epidemiología de la leishmaniosis en la provincia de Sevilla
(2006-05-31) Reina Mulero, Francisco; Úbeda Ontiveros, José Manuel; Ariza Astolfi, Concepción; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
Estudio epidemiológico de caries y razón costo/beneficio después de tres años de fluoruración en el Pedroso
(1984-04-03) González Serrano, Aníbal; Perea Pérez, Evelio José; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
Despues de 3 años de fluoruracion ha habido una reduccion de un 33% en el indicede caries dental. Previo a la fluoruracion habia un 84 8% de los niños padecian de caries dental. La razon costo-beneficio fue de 1/11 85. Por cada peseta invertida en fluoruracion se ahorraran 11 85 ptas en tratamientodental.
Etiopatogenia de la retinosis pigmentaria autosomica recesiva (RPAR) caracterización de genes candidatos y evaluación de su implicación en el desarrollo de RPAR
(2002-11-25) Marcos Luque, Irene; Antiñolo Gil, Guillermo; Palomares Díaz, Antonio José; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
Epidemiología del parasitismo intestinal infantil en la provincia de Castellón
(1989-05-23) Catalán Garcés, Julio; Ubera Ontíveros, José Manuel; Guevara Benítez, Diego C.; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
Implicación del gen de poligalacturonasa en la simbiosis rhizobium-leguminosa aislamiento, secuenciación y analisis de expresión
(1995-04-06) Muñoz Sánchez, José Antonio; Palomares Díaz, Antonio José; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
En las primeras etapas de la interaccion rhizobium-leguminosa se produce la penetracion de la bacteria a traves de la pared del pelo radical. En este mecanismo de entrada parecen estar implicados enzimas hidroliticos que degradan la pared celular. El objetivo de este trabajo ha sido determinar la existencia de enzimas pecticos en leguminosas y analizar su posible implicacion en la simbiosis. Se ha clonado el gen de poligalacturonasa (pg) de tomate bajo el control de los promotores tac y trc y expresado en e. Coli y en rhizobium, lo que ha permitido poner a punto las tecnicas de deteccion de actividad pg. Se han aislado y secuenciado tres productos de pcr, con homologia a regiones conservadas entre diferentes pgs de plantas, a partir de adn genomico de m. Truncatula (e2 y e3) y de adnc de polen de m. Sativa (pl1) y otros dos a partir de trifolium subterraneum (tf6 y tf7). E2 y pl1 pertenecen a un gen de pg que forma parte de una pequeña familia genica y que se expresa fuertemente en flores maduras y no en raices o nodulos. E3 pertenece a un gen de pg que se encuentra en una sola copia y se expresa en raices inoculadas con la cepa silvestre de r. Meliloti y muy debilmente en raices no inoculadas o inoculadas con un mutante nod-. La expresion se detecta en raices un dia despues de la inoculacion. Los transcritos no se detectan en flores y si en nodulos inducidos por la cepa silvestre. Se ha detectado una induccion en nodulos de 31 dias inducidos por la cepa silvestre con respecto a nodulos de 7 dias y, ademas, una mayor expresion en nodulos inducidos por un mutante fix exo- con respecto a los nodulos inducidos por la cepa silvestre. Tambien se ha detectado una ligera induccion de la expresion en raices heridas e inoculadas con pseudomonas 17 horas despues de haberse tratado. Se ha clonado y secuenciado parcialmente el gen de pg de m. Sativa de expresion en nodulo y raiz. Este fragmento presenta tres intrones, codificando el orf iden
Caracterización de cepas de Sinorhizobium aisladas de suelos brasileños
(1998) Gómez Coca, Raquel Beatriz; Megías Guijo, Manuel; Hungria, Mariangela; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
Caracterización molecular de especies del género Trichuris
(2001-04-02) Oliveros Salvador, Rocio; Guevara Benítez, Diego C.; Cutillas Barrios, Cristina; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
La diferenciación específica del género Trichuris constituye un gran problema, ya que, entre las muchas especies descritas de este género, pueden existir sinonimias como consecuencia de haber sido encontrada en un hospedador distinto al habitual, cuando en realidad está demostrado que la influencia de los hospedadores en las especies puede dar como resultado a un gusano con diferentes dimensiones morfológicas. Además, la variaciones mofrológicas pueden reflejar adaptaciones fenotítpicas de un parásito al miedo ambiente, idependientemente de cualquier tipo de diferencia genética. Actualmente, la aplicación de técnicas moleculares al estudio sistemático de muchas especies parásitos ha clarificado situaciones semejantes a la encontrada en Trichuris. La técnica más ampliamente utilizada, en los últimos años, es la técnica de amplificación del ADN mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa. El principal objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido clarificar la situación taxonómica del género Trichuris mediante el estudio molecular del ITS1 e ITS2, como marcadores específcios, el gen 5,8S como marcador conservativo. Este estudio se ha basado en la extracción, amplificación, clonación, secuenciación, y elaboración de los mapas de restricción característico para cada una de las especies de Trichuris objeto de estudio, y posterior estudio comparativo de las secuencias obtenidas. Los datos de secuencias obtendios confirma la sinonimia de las especies T. Ovis y T. Globulosa, propuesta anteriormente mediante estudios isoenzimáticos, Así mismo, se acepta la existencia de dos especies crípticas, T, muris yT. Arvicolae, parasitando C. Glareolus. Los resultados obtenidos tras la amplificación de los espaciadores transcritos internos 1 y 2 (ITS1, ITS2) del ADNr de las distitnas especies de Trichuris, mediante la técnica de PCR, nos permite concluir la utilidad de esta técnica en la taxonomía de nematodes
Rizoremediación de suelos contaminados por metales pesados mediante la simbiosis rhizobium-leguminosa. Análisis particular de la contaminación por cobre
(2007-04-25) Carrasco López, José Antonio; Pajuelo Domínguez, Eloísa; Chamber Pérez, Manuel A.; Palomares Díaz, Antonio José; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
Análisis de la expresión génica y marcaje de bacterias del género Rhizobium mediante utilización de genes de luciferasa eucarioticos
(1993) Cebolla Ramírez, Ángel; Palomares Díaz, Antonio José; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología

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