Resumen | Los mastocitos son una población de células heterogéneas, localizadas en los
tejidos conectivos del organismo, que desarrollan respuestas alérgicas y
antiparasitarias mediadas por la IgE y otros receptores. Estas células ...
Los mastocitos son una población de células heterogéneas, localizadas en los
tejidos conectivos del organismo, que desarrollan respuestas alérgicas y
antiparasitarias mediadas por la IgE y otros receptores. Estas células generan
reacciones urgentes donde la inflamación es, en sí, un mecanismo protector frente a
la amenaza detectada, cuyo objetivo es restaurar la homeostasis en el tejido dañado
eliminando o aislando el agente causante que la puso en marcha. Para ello, y tras
apenas unos treinta minutos desde que se detectó el estímulo comienza su etapa
aguda, durante la cual los mastocitos vierten al tejido las moléculas preformadas y
almacenadas en sus gránulos, produciéndose en consecuencia cambios morfológicos
y fisiológicos característicos de los procesos inflamatorios. Todo ello, se traduce en
la aparición de sus signos característicos calor, rubor, dolor y tumor. Posteriormente,
y si sigue actuando el instigador, se desarrolla la fase tardía (dos horas tras el
estímulo) donde se sintetizan y liberan leucotrienos y prostaglandinas, así como
citoquinas entre las que se encuentran: IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, TNF-α, IL-8, IL-10,
IL-13. Dicho mecanismo es de gran importancia para el organismo, y es por ello que
los tejidos, para asegurar su activación, establecen estrategias redundantes. Sin
embargo, cuando la amenaza es eliminada resolver los diferentes frentes establecidos
que activaron la inflamación puede convertirse en una empresa complicada. Es por
ello, que la investigación en este campo se enfoca, al menos en parte, en la búsqueda
o desarrollo de fármacos que permitan su resolución con éxito evitando su
cronificación.
Siguiendo esta línea, uno de los fármacos estudiados es la melatonina, la cual es
una indolamina que presenta gran variedad de propiedades. Así, cabe destacar que
durante el proceso inflamatorio desarrolla un papel dual por el cual funciona como
una citoquina pro-inflamatoria más, y posteriormente, cuando ya no es necesario
ayuda a la restitución de la homeostasis gracias a sus muchas capacidades como son
la antioxidante, citoprotectora, inmunomoduladora y anti-inflamatoria.
Concretamente, a través de ellas consigue reducir los radicales libres procedentes del
metabolismo del oxígeno y del nitrógeno, mejorar la viabilidad celular, estimular o
reducir la respuesta inmune e inhibir la activación del factor NF-κβ.
OBJETIVOS:
En nuestro estudio se establecieron dos objetivos principales: analizar el efecto
del tratamiento exógeno de la melatonina, una molécula inmunomoduladora, sobre la
línea de mastocitos RBL-2H3, modelo de inflamación in vitro, e identificar los
mecanismos celulares y moleculares que subyacen a estos efectos y, también,
trasladar nuestros descubrimientos básicos a la clínica.
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HÍPOTESIS:
En función de nuestros objetivos establecimos las hipótesis en las que
trabajamos. A través de ellas, queríamos conocer si la administración exógena de la
melatonina:
- Mejora la viabilidad celular y la regeneración del mastocito tras el estímulo
químico.
- Si inhibe la activación del mastocito reduciendo la síntesis y liberación de
citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α e IL-6).
- Si interviene en la síntesis y liberación de la melatonina endógena por parte
del mastocito.
MATERIAL Y MÉTODOS:
Se usaron cultivos de mastocitos RBL-2H3 que crecieron en medio con suero
fetal bovino descomplementado, CO2 al 5% y 37ºC, los cuales fueron sometidos a
diferentes tiempos de estimulación química mediante forbol-12-miristato-13-acetato
más calcio ionóforo (PMACI) para conocer su inducción de citotoxicidad o su efecto
sobre la liberación de las citoquinas pro-inflamatorias. Posteriormente, se realizaron
pre-tratamientos con melatonina (durante 30 minutos) a concentraciones fisiológicas
y farmacológicas para estudiar su capacidad citoprotectora y su efecto sobre la
liberación de citoquinas y los niveles de melatonina endógena. Por otro lado, se
estudió el efecto del antagonista selectivo luzindol sobre sus capacidades
citoprotectoras. A su vez, estudiamos el efecto de la melatonina sobre la liberación
de las citoquinas pro-inflamatorias y la propia melatonina endógena y sobre los
mecanismos intracelulares responsables de la citoprotección.
Para ello, se usó el ensayo MTT para estudiar la viabilidad celular, así como la
técnica de enzimoinmunoanálisis (ELISA) para la medición de citoquinas en el
sobrenadante del medio de cultivo. Para el estudio de la expresión proteica de la
miosina IIa e IKKα/β se usó la técnica de western blotting, un sistema de
transferencia semiseca y un sistema de detección de proteínas mediante
quimioluminiscencia.
RESULTADOS:
El ensayo de MTT nos permitió determinar que la citotoxicidad generada sobre
los cultivos mastocitarios con el estímulo químico (PMACI) era tanto dosis como
tiempo dependiente. Así, y de manera estadísticamente significativa, a mayor tiempo
de exposición al PMACI, mayores eran los daños celulares detectados; los cuales
fueron extremos ante periodos iguales o mayores a 14 horas. Detectamos, también,
que dicha estimulación con PMACI produce un aumento en la liberación de las
citoquinas pro-inflamatorias TNF-α e IL-6, así como de la melatonina endógena, los
cuales disminuyeron si fueron precedidos del pre-tratamiento con melatonina.
Se observó que el pretratamiento con melatonina (30 minutos) mejoró la
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viabilidad celular de modo estadísticamente significativo, siendo mayor su capacidad
a concentraciones farmacológicas; mientras que las concentraciones fisiológicas
muestran esta capacidad citoprotectora tras 12 horas de experimentación. Aunque
cabe destacar que en presencia del antagonista selectivo para los receptores MT1 y
MT2 llamado luzindol, su capacidad citoprotectora disminuye, aunque no del todo.
Por último, se detectó que el pretratamiento con melatonina disminuye la
activación del complejo IKKα/β lo que le permite desarrollar su papel
anti-inflamatorio.
CONCLUSIONES:
La estimulación química mediante PMACI activa a los mastocitos de manera
tiempo y dosis dependiente.
El pretratamiento con melatonina, sobre todo a concentraciones farmacológicas,
ejerce protección celular cuando los mastocitos fueron estimulados con PMACI.
La estimulación química mediante PMACI introduce al mastocito en un estado
de hiperestimulación con un aumento de los niveles de TNF-α, IL-6 y de melatonina
endógena; cuando se realizó el pretratamiento con melatonina disminuyó la síntesis y
liberación de las mismas. Esta capacidad se revierte en presencia de luzindol.
La melatonina exógena en ausencia de estimulación química no afecta los
niveles de TNF-α, IL-6 o de melatonina endógena (MELn).
El pretratamiento con melatonina, tanto a concentraciones fisiológicas como
farmacológicas, en mastocitos estimulados, inhibe la activación de la ruta de
activación mastocitaria IKK/NF-κβ de forma estadísticamente significativa.
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