Colonización fúngica en pacientes con fiibrosis quísticas sometidos a trasplante pulmonar.

Abstract

Los pacientes con fibrosis quística constituyen un grupo de riesgo para la colonización por Pneumocystis jirovecii y otras especies de hongos y bacterias. Se trata de una enfermedad hereditaria en la que las manifestaciones crónicas broncopulmonares constituyen el problema clínico más frecuente, siendo el trasplante pulmonar la única alternativa final para la mayoría de los casos. Entre las principales causas de morbimortalidad en los pacientes trasplantados se encuentran las infecciones, destacando las de origen fúngico como la aspergilosis invasiva o la neumonía por Pneumocystis jirovecii. Cuando éstos son sometidos a inmunosupresión por el trasplante, son susceptibles de desarrollar infecciones invasivas con elevada mortalidad. Existen escasos datos sobre la colonización fúngica en afectados por fibrosis quística que han recibido un trasplante pulmonar, por lo que uno de los objetivos de esta tesis es conocer los géneros y especies que se pueden presentar en este grupo de pacientes y su dinámica, así como analizar si existen diferencias con respecto a los afectados por esta enfermedad no trasplantados. Del mismo modo, no se dispone de biomarcadores que permitan identificar estas situaciones, por lo que resulta de gran interés comprobar la utilidad de la determinación de los niveles séricos de (1→3)-β-D-glucano para su detección. Se han incluído 11 pacientes trasplantados y 13 controles, atendidos en la Unidad de referencia regional en fibrosis quística del Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla, que han sido seguidos durante un año, con revisiones cada seis meses. El análisis de las muestras biológicas (lavado orofaríngeo y sangre periférica) se ha realizado en los laboratorios con los que cuenta el grupo de investigación en el Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) mediante técnicas de biología molecular: PCR anidada para el diagnóstico de la presencia de P. jirovecii y su caracterización genotípica por secuenciación directa, técnicas de metagenómica utilizando la amplificación de la región ITS para la determinación de otros hongos, PCR específicas para P. aeruginosa y S. pneumoniae y cuantificación de los niveles séricos de (1→3)-β-D-glucano mediante el test Fungitell®. En nuestro trabajo hemos podido observar que en el grupo de sujetos sin enfermedad pulmonar, se identificó en todas las muestras la presencia de hongos que correspondían a hongos ambientales y Candidas. Los niveles de betaglucano fueron inferiores a 60 pg/ml en todos los casos y únicamente se correlacionó significativamente con la presencia de Debaryomyces (p= 0,004). P. jirovecii estaba presente en el 33,3% de los sujetos y la media de betaglucano en ellos fue de 8,6 ± 1,1 pg/ml y en los que no se detectó este hongo de 13,2 ± 8,4 pg/ml, no siendo la diferencia estadísticamente significativa (p= 0,507). La colonización por S. pneumoniae estaba presente en la mitad de las muestras estudiadas y en ninguna P. aeruginosa. Los niveles medios de betaglucano en los colonizados por S. pneumoniae fue de 16,7 ± 12,6 pg/ml y en los no hubo ninguna de estas dos especies de 8,6 ± 1,1 pg/ml, sin diferencia estadísticamente significativa (p= 0,460). En el grupo de pacientes con fibrosis quística predominó Candida seguida de Cladosporium. En cuanto a los niveles de betaglucano, el 57,1% alcanzaron cifras ≥ 80 pg/ml, y el 42,9% restante no llegaron a 60 pg/ml, siendo la media de 118,6 ± 140,5 pg/ml. P. jirovecii estaba presente al inicio en el 85,7%, a los seis meses en el 100% y al año en el 42,9% y la media de betaglucano en los pacientes portadores de este hongo fue de 110,6 ± 157,5 pg/ml y en los otros de 138,5 ± 101,7 pg/ml, sin significación estadística (p= 0,752). En el estudio bacteriológico, se encontraron siete muestras colonizadas por P. aeruginosa y en tres de ellas además S. pneumoniae. Los niveles de betaglucano correspondientes a las muestras en las que se aísla un género bacteriano fue de 169,3 ± 78,9 pg/ml y en las que se hallaron ambos, de 65,3 ± 39,9 pg/ml, sin existir diferencia estadísticamente significativa (p= 0,095). En el grupo de pacientes trasplantados, Candida fue el género más frecuentemente encontrado. En el 43,5% de las muestras estudiadas se aisló un solo género y en el 56,5% restante se identificaron dos o más. El 56,5% del total arrojaron cifras de betaglucano superiores a 80 pg/ml, el 17,4% se encontraron entre 60-79 pg/ml y el 26,1% inferiores a 60 pg/ml. La cantidad media de betaglucano en las muestras que estaban colonizadas por Candida fue de 83,1 ± 37,2 pg/ml y en las que no lo estaban por dicho microorganismo de 85,2 ± 19,4 pg/ml, sin diferencias estadísticamente significativas (p= 0,896). La colonización por P. jirovecii fue de 45,5% al inicio, 36,4% a los seis meses y 54,5% al año, siendo el genotipo 3 el más frecuente. En ningún caso se detectó la coexistencia de varios genotipos. En los pacientes con presencia de dicho agente la media de betaglucano fue 87,6 ± 37,7 pg/ml y en los que no se detectó de 73,6 ± 35,7 pg/ml, sin diferencias estadísticamente significativas (p= 0,371). En cuanto a la colonización bacteriana, en nueve del total de las muestras se halló P. aeruginosa (recogidas en siete de los once pacientes) y en doce S. pneumoniae (tomadas en ocho de los once enfermos). En el conjunto de los enfermos el nivel medio de betaglucano fue de 79,7 ± 27,7 pg/ml, en los que se aisló uno de los dos géneros fue de 81,9 ± 26,7 pg/ml y en los que se identificaron ambos fue de 82,3 ± 26,6 pg/ml. En los individuos no colonizados fue de 74,6 ± 33 pg/ml, sin diferencias estadísticamente significativas (p= 0,852). Podemos concluir que los pacientes con fibrosis quística sometidos a trasplante pulmonar presentan colonización fúngica, por distintos géneros y especies, con una tendencia al predominio de Candida y Pneumocystis. Asímismo, éstos sufren una dinámica continua de colonización y aclaramiento tanto de P. jirovecii como de otros hongos, observando un incremento del número de taxones presentes a lo largo del tiempo. En cuanto a los enfermos con fibrosis quística, la presencia fúngica aumenta con el tiempo. Por último, la determinación delos niveles séricos de (1→3)-β-D-glucano no resulta útil como marcador de colonización fúngica ni en pacientes con fibrosis quística ni en trasplantados de pulmón.

Patients suffering from cystic fibrosis are a group of risk for Pneumocystis jirovecii and other fungal and bacterial species colonization. This is a hereditary disease in which chronic pulmonary manifestations are the main clinical problem, and actually lung transplantation is the best treatment for those patients. Infections are the main causes of morbidity and mortality in transplanted patients, mainly fungal infections as invasive aspergilosis or Pneumocystis jirovecii pneumonia. When these patients receive immunosuppressive therapy are in special risk for invasive fungal infections with high mortality rate. There are only a few studies about fungal colonization in cystic fibrosis patients suffering from lung transplantation, therefore one of the objective of present Thesis aims to describe the fungal genera and species that may colonize this group of patients and their dinamic, and also, to analyze if there are any difference with cystic fibrosis patients. In the same way, there are no identified biomarkers for these situations, so that it would be especially useful if we could use the (1→3)-β-D-glucans an aid to identify colonization in those patients. Eleven transplant patients and 13 controls from Cystic Fibrosis Regional Reference Unit at Virgen del Rocío University Hospital have been included in the study. They have been followed along a year with revision visits every six months. The analysis of the samples (oropharyngeal washes and peripheral blood) has been carried out at the Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) laboratory using molecular techniques: nested PCR for P. jirovecii and direct sequencing for genotipic characterization, metagenomic approach based on fungal ITS region, specific PCR for P. aeruginosa and S. pneumoniae and the levels of (1→3)-β-D-glucans by the test Fungitell®. In present study, individuals without lung disease were colonizated mainly by common indoor and outdoor molds and Candida sp. Betaglucan was inferior to 60 pg/ml in all cases and Debaryomyces was the only one statistically significant (p= 0.004). P. jirovecii was present in the 33.3% of the cases. The average betaglucan level in the patients with this microorganism was 8.6 ± 1.1 pg/ml and in the patients without colonization was 13.2 ± 8.4 pg/ml, without statistically significant difference (p= 0.507). S. pneumoniae was present in half of the studied samples and P. aeruginosa in none of them. The average betaglucan level was 16.7 ± 12.6 pg/ml in the group of colonizated patients, and 8.6 ± 1.1 pg/ml in the uncolonizated patients, without statistically significant difference (p= 0.460). In the cystic fibrosis group, Candida was the most frequent fungus followed by Cladosporium. The betaglucan levels were ≥ 80 pg/ml in the 57.1% of the samples and inferior to 60 pg/ml in the remaining 42.9%, being the average betaglucan level 118.6 ± 140.5 pg/ml. P. jirovecii was present in the 85.7% of the cases at the initiation of the study, 100% at six months and 42.9% at one year follow-up. The average betaglucan level was 110.6 ± 157.5 pg/ml in the colonization group and 138.5 ± 101.7 pg/ml in the uncolonization group, without statistically significant difference (p= 0,752). In the bacteriological study, seven samples were colonizated by P. aeruginosa and also S. pneumoniae in three of them. The average betaglucan level was 169.3 ± 78.9 pg/ml in the samples with one bacterial genera and 65.3 ± 39.9 pg/ml in the ones with both genera, without statistical significance (p= 0.095). In the transplant patients group, Candida was the most predominant fungus. One genera was present in the 43.5% of the samples and two or more were present in the other 56.5%. The betaglucan level was superior to 80 pg/ml in the 56.5% of the cases, between 60-79 pg/ml in the 17.4% and inferior to 60 pg/ml in the 26.1%. The average betaglucan level of Candida colonizated samples was 83.1 ± 37.2 pg/ml and 85.2 ± 19.4 pg/ml in the uncolonizated samples, without statistically significant difference (p= 0.896). Frequency of P. jirovecii colonization was 45.5% at the initiation, 36.4% at six months and 54.5% at one year follow-up, being genotype 3 the most common. In any case we found more than one genotype. The average betaglucan level was 87.6 ± 37.7 pg/ml in colonizated patients and 73.6 ± 35.7 pg/ml in the uncolonizated group, without statistical significance (p= 0.371). In the bacteriological study, P. aeruginosa was present in nine samples (collected in seven out of eleven patients) and S. pneumoniae in twelve (from eight out of eleven patients). The average betaglucan level was 79.7 ± 27.7 pg/ml in the total of samples, 81.9 ± 26.7 pg/ml in the samples with one genera and 82.3 ± 26.6 pg/ml in the samples with both genera. The betaglucan level in uncolonizated patients was 74.6 ± 33 pg/ml without statistical significance (p= 0.852). We can conclude that lung transplant cystic fibrosis patients suffer fungal colonization by different genera and species, being Candida sp. and Pneumocystis jirovecii the most predominants. Further, these patients have a continuous colonization and clearance dynamic cycle of P. jirovecii and other fungi, showing an increasing number of taxa over the follow-up time. The fungal colonization in cystic fibrosis patients grow over time. Finally, the determination of (1→3)-β-D-glucan level do not seem to be a useful tool for the detection of fungal colonization in cystic fibrosis patients nor trasplant patients.