Caracterización de subpoblaciones de micropartículas en pacientes con enfermedad tromboembólica venosa

Abstract

La enfermedad tromboembólica venosa (ETV) en su expresión trombosis venosa profunda y/o embolia pulmonar es una enfermedad multifactorial compleja de considerables dimensiones. Su relación con el cáncer está bien establecida, un porcentaje no despreciable de pacientes con ETV son posteriormente diagnosticados de cáncer y a su vez una de las complicaciones más frecuentes en los pacientes con cáncer es la enfermedad tromboembólica. En todas las neoplasias se genera un estado de hipercoagulabilidad, pero determinados tipos como el cáncer de pulmón, el de páncreas, o los cánceres gástricos tienen una mayor incidencia de ETV y se encuentran más asociados a la trombosis. La aparición de ETV en pacientes con cáncer se asocia con un peor pronóstico y un difícil manejo desde el punto de vista clínico. La comunidad científica se centra en el hallazgo de biomarcadores que permitan un diagnóstico precoz de la neoplasia subyacente en los pacientes con ETV y una mejor estratificación del riesgo de ETV en los pacientes con cáncer. En este sentido, uno de los biomarcadores estudiados más prometedores son las micropartículas (MPs). Las MPs son unas microvesículas de entre 0,1- y 1-μm de diámetro liberadas al torrente circulatorio por diferentes tipos celulares en situaciones de activación daño celular o apoptosis. Inicialmente se consideraban polvo celular desprovisto de cualquier función biológica pero hoy en día se consideran un fiel reflejo de la activación y/o regeneración tisular in vivo. Sus propiedades y características dependen de la célula y el estímulo que las origine y aunque se han detectado MPs en sujetos sanos, niveles elevados se han encontrado en pacientes con diversas patologías entre las que se incluyen la ETV y el cáncer. Hasta ahora la mayoría de estudios diseñados son estudios de cohortes longitudinales centrados en las MPs como posibles biomarcadores del evento trombótico en el paciente con cáncer y aún no resultados concluyentes al respecto. La facilidad con la que los niveles y propiedades de las MPs circulantes se alteran ex vivo y la variabilidad de protocolos utilizados en los laboratorios porque no existe un protocolo estandarizado de aislamiento y detección de MPs podrían explicar los resultados inconsistentes entre los diferentes trabajos. Esta tesis se centra en el estudio, caracterización y cuantificación de diferentes tipos de MPs circulantes en pacientes con ETV idiopática y pacientes con cáncer que no han desarrollado ETV. Nuestro objetivo fue identificar alguna población o poblaciones de MPs características de la ETV o del cáncer que nos permitieran discriminar entre ambas enfermedades y que pudieran servir para el diseño de futuros estudios. Debido a la necesidad de conseguir un protocolo consensuado que facilite una medición precisa, objetiva y reproducible de las MPs, como paso previo a la caracterización de MPs en los pacientes con ETV y pacientes con cáncer, se llevaron a cabo dos estudios metodológicos que también se han recogido en esta tesis. El primero de ellos evaluaba el impacto de la centrifugación y congelación del plasma sobre los niveles de MPs y su capacidad procoagulante. Se preparó plasma de 21 sujetos sanos siguiendo 4 protocolos de centrifugación: 1500 g 30 min 4 ºC; 1500 g 30 min 20 ºC; 2x2500 g 10 min 4 ºC y 2x2500 g 10 min 20 ºC. Se determinaron los niveles de MPs totales y su actividad progoaculante mediante citometría y ensayos funcionales respectivamente. Las determinaciones se realizaron sobre el plasma freso y sobre el plasma tras un ciclo de congelación-descongelación. En nuestros resultados observamos que el aumento de la velocidad de centrifugación disminuía significativamente los niveles y la actividad de las MPs detectados en el plasma, mientras que la temperatura de centrifugación no afectaba a ninguna de las propiedades de las MPs. La congelación-descongelación del plasma también afectaba, aumentando significativamente los niveles de MPs totales y su actividad procoagulante. Estas observaciones indicaban que la comparación de resultados entre laboratorios estaba muy limitada si la velocidad de centrifugación y condiciones de conservación de la muestra no habían sido las mismas. Sin embargo, habría puertas hacia la comparación de resultados entre muestras procesadas con protocolos idénticos de velocidad y tiempo de centrifugación pero con diferentes condiciones de temperatura. El segundo estudio metodológico se centraba en la evaluación de una nueva estrategia de calibración de los citómetros de flujo como herramienta para la optimización en la detección de MPs y la comparación de resultados entre diferentes plataformas citométricas. La citometría de flujo, es el método más empleado para la medición de MPs, la mayoría de trabajos utilizan bolas fluorescentes de diferentes tamaños para la calibración de los citómetros pero la falta de un protocolo de calibración consensuado junto con la variabilidad que existen en los citómetros en cuanto a su capacidad de resolución se refiere hace que la comparación fiable de resultados sobre MPs entre citómetros con diferentes características técnicas esté muy limitado. Nuestro objetivo era evaluar una nueva estrategia de calibración basada en dos combinaciones diferentes de bolas fluorescentes especialmente diseñadas para establecer una región de MPs que sea comparable entre citómetros que tengan una mayor capacidad de resolución en el parámetro citométrico “ forward scattered light” (FS, da información sobre el tamaño de las MPs) y citómetros que tengan una mayor capacidad de resolución en el parámetro “side scattered light” (SS, da información sobre la complejidad de las MPs). Para llevarla a cabo se cuantificaron en muestras de plasma de 65 pacientes los niveles de MPs totales y MPs de procedencia plaquetar (PMPs) en dos tipos de citómetros, uno optimizado para el parámetro FS (citómetro Navios) y otro optimizado para SS (citómetro LSR Fortessa). En nuestros resultados observamos que los niveles tanto de MPs totales como de PMPs detectados en el citómetro Navios se encontraban significativamente más elevados que en el citómetro LSR Fortessa. Sin embargo, se encontró una alta y significativa correlación positiva entre los resultados de ambos citómetros tanto para los niveles de MPs totales como para los niveles de PMPs. Basándonos en nuestros hallazgos podemos decir que la determinación de MPs en citómetros calibrados siguiendo esta estrategia es un método fiable. La comparación de resultados en valor absoluto entre citómetros con diferentes características técnicas para FS y SS no es posible, en su lugar debe realizarse una comparación relativa o porcentual de los resultados la cual sí es fiable y precisa.