Incidencia y epidemiología de nuevos hongos patógenos de fresa en la provincia de Huelva. Desarrollo de herramientas biotecnológicas y aplicación de otras estrategias de control

Abstract

España es el cuarto productor mundial de fruto de fresa. Su cultivo tiene lugar en dos etapas y en dos zonas geográficas diferentes de la península. El material de partida, las plantas madre, proceden en su mayoría de EEUU (California y Florida). La producción de plantas de fresa tiene lugar al aire libre, entre abril y mayo, en suelos arenosos de viveros de tierras altas de Castilla y León (viveros de altura). Tras la acumulación de horas-frío, se consigue una adecuada multiplicación vegetativa y madurez fisiológica. Estas plantas son recolectadas durante los meses de septiembre y octubre, y enviadas a las zonas de producción de fruto de la provincia de Huelva, donde tiene lugar su desarrollo vegetativo, floración y fructificación, entre los meses de octubre a junio. El cultivo de la fresa en España está seriamente amenazado por la emergencia o reemergencia de hongos patógenos de suelo que infectan a este cultivo. En esta Tesis Doctoral se ha constatado la presencia de tres hongos patógenos de fresa (Fusarium oxysporum, Macrophomina phaseolina y Phytophthora cactorum) en viveros de altura de Castilla y León y en campos de producción de fruto de la provincia de Huelva. Para ello, y como primera medida preventiva de control, se han desarrollado y aplicado métodos moleculares de diagnóstico, consistentes en i) PCR en tiempo real para su detección y cuantificación de una manera sensible, específica, rápida y fiable y ii) secuenciación de regiones variables del genoma de cada hongo para su identificación y análisis filogenético. Paralelamente, se ha testado la patogenicidad de aislados de Fusarium spp. procedentes de muestras de suelo y plantas sintomáticas de campos de producción mediante i) pruebas de patogenicidad y ii) detección por PCR de marcadores de patogenidad descritos en otras formae speciales de F. oxysporum (el factor de transcripción ftf1) y en aislados patógenos de F. oxysporun f. sp. fragariae (el fragmento fofra). La incidencia de aislados patógenos de F. oxysporum en el cultivo de la fresa es prácticamente nula, pues desde su detección en 2008 por Arroyo y col., (2009) y a pesar de que ha aumentado la presencia de este hongo en viveros de altura y campos de producción a lo largo de las tres campañas prospectadas, sólo se ha detectado un aislado de F. oxysporum capaz de ocasionar enfermedad en plantas de fresa. Los marcadores de patogenicidad descritos no han permitido distinguir aislados de F. oxysporum patógenos de los no patógenos. Sin embargo, estos estudios de prospección y caracterización patogénica han permitido la detección de un nuevo patógeno para el cultivo de la fresa: Fusarium solani, capaz de provocar enanismo, marchitez y muerte ocasional de las plantas. Los análisis filogenéticos permitieron determinar que la población de F. solani del cultivo de la fresa es la que posee mayor diversidad nucleotídica intrapoblacional y la que tiene mayor distancia genética respecto al resto de poblaciones de Fusarium estudiadas. Por otro lado, M. phaseolina se detectó en las dos regiones geográficas del cultivo de la fresa, en suelos de viveros de altura, donde no se había referido con anterioridad, y en suelos y plantas sintomáticas de campos de producción. Debido a su ausencia en plantas madre prebase y plantas hija certificadas, se sugiere que el origen de la infección con M. phaseolina podría estar en los suelos de campos de producción de fruto y que los productos químicos que se usan para su desinfestación al inicio de cada campaña (generalmente 1,3-D+CP) no son suficientemente eficientes para eliminar este patógeno. P. cactorum, a pesar de ser un patógeno incluido en el ¿Reglamento técnico de control y certificación de plantas de vivero de frutales¿, se ha detectado también en distintos estadios de este cultivo, en suelos sin desinfestar de viveros de altura, en plantas hija certificadas y en suelos y plantas sintomáticas de campos de producción de fruto. Se sugiere por tanto que la fuente de inóculo de este patógeno se encuentra en los suelos no eficientemente desinfestados de estos campos, donde este patógeno sobrevive campaña tras campaña. La presencia de P. cactorum también se ha relacionado con el cultivar de fresa que se cultiva en una campaña determinada, siendo en nuestro estudio más frecuente en plantas `Fortuna¿ que en `Sabrina¿,`Splendor¿ o `Primoris¿. En un intento por desarrollar estrategias preventivas de control basadas en la detección temprana de estos hongos en el cultivo de la fresa, en este trabajo de tesis se ha desarrollado una herramienta molecular consistente en una polisonda para la detección simultánea de tres hongos patógenos de fresa: F. oxysporum f. sp. fragariae, M. phaseolina y Verticillium dahliae. Esta sonda permite la detección específica de estos hongos en material vegetal infectado permitiendo el análisis simultáneo de un gran número de muestras. Este sistema se podría aplicar en programas de certificación de plantas de vivero de fresa como estrategia de prevención, evitando así la introducción de hongos patógenos en campos de cultivo. En este trabajo se han llevado a cabo estudios de rango de huéspedes para comprobar si aislados patógenos de fresa, pertenecientes a los complejos de especies de F. oxysporum y F. solani, son capaces de ocasionar enfermedad en otros cultivos o, por el contrario, son específicos de fresa. A su vez, se ha pretendido determinar si las formae speciales de F. oxysporum descritas como patógenos para otros cultivos son capaces de causar enfermedad en el cultivo de la fresa. Estos estudios epidemiológicos son de gran importancia en el diseño de las rotaciones de cultivos. Aunque el cultivo de fruto de fresa en nuestro país se desarrolla actualmente como monocultivo, es importante llevar a cabo este tipo de estudios epidemiológicos como visión de futuro, al tratarse de hongos patógenos con una elevada capacidad de supervivencia en el suelo. Los resultados han demostrado que F. oxysporum f. sp. fragariae patógeno de fresa (Fof) es capaz de infectar a plantas de ajo, espárrago y tomate, aunque la severidad de los síntomas causados en estos cultivos es mucho menor que los causados por aislados de F. oxysporum patógenos de cada uno de ellos (F. oxysporum f. sp. cepae, F. oxysporum f. sp. asparagi y F. oxysporum f. sp. radicis-lycopercisi, respectivamente). Del mismo modo, se determinó que los aislados de F. oxysporum patógenos de ajo, espárrago y tomate fueron capaces de infectar plantas de fresa in vitro y cultivadas en sustrato, aunque sólo causaron síntomas en condiciones in vitro y éstos fueron poco severos. Por otro lado F. solani patógeno de fresa no resultó específico para el cultivo de la fresa ya que produjo enfermedad en ajo, espárrago y tomate, disminuyendo el vigor de las plantas y afectando por tanto su producción. Una vez que los hongos se han establecido en el cultivo, es importante contar con medidas de control eficaces para evitar su propagación y disminuir los daños. Debido a la prohibición por parte de la EU de la comercialización y uso de la gran mayoría de las sustancias activas utilizadas para la desinfestación del suelo en el cultivo de la fresa, se han buscado alternativas no químicas eficaces para el control de hongos patógenos de suelo y a la vez respetuosas con el medioambiente y la salud humana. En este trabajo se ha evaluado la eficacia de dos productos comerciales, uno de ellos basado en la cepa T18 de Trichoderma asperellum (Prodigy®) y el otro compuesto por dos especies de Bacillus, B. megaterium B157 y B. laterosporus B197 (Fusbact®) en el control de las enfermedades del cultivo de la fresa provocadas por M. phaseolina y F. solani. Para ello, se llevaron a cabo enfrentamientos duales in vitro, y ensayos en cámara de cultivo o invernadero, y en condiciones de campo. En los enfrentamientos duales realizados in vitro, se observó el efecto antagónico de los dos agentes de biocontrol frente a M. phaseolina y F. solani. Ambos fueron capaces de inhibir el crecimiento radial de los dos patógenos en más de un 30%. En los experimentos llevados a cabo in vivo, tanto en macetas en condiciones controladas como en condiciones de campo, el formulado comercial basado en T. asperellum T18 mostró su eficacia en el control biológico de M. phaseolina y F. solani cuando se aplicó por inmersión de las raíces y la corona de las plantas en una suspensión del producto, antes de su trasplante. La efectividad de Bacillus spp. como agente de biocontrol de M. phaseolina y F. solani fue menos consistente que la mostrada por T. asperellum T18, variando su eficacia en función de las condiciones experimentales. En este trabajo se ha demostrado que, los formulados biológios basados en T. asperellum y Bacillus spp. utilizados de forma preventiva y aplicados por inmersión podrían constituir una estrategia eficaz y alternativa al uso de los fungicidas químicos en la lucha contra la Podredumbre carbonosa y la Fusariosis ocasionada por F. solani en el cultivo de la fresa. Esta Tesis Doctoral aporta conocimientos sobre la presencia y el posible origen de las enfermedades provocadas por los hongos patógenos F. oxysporum, M. phaseolina y P. cactorum en el cultivo de la fresa. Se han desarrollado medidas preventivas de control basadas en la detección temprana de estos patógenos en material vegetal que podrían ser incluidas en protocolos de certificación de plantas de fresa. Se han llevado a cabo estudios epidemiológicos sobre la capacidad infectiva de especies patógenas de F. oxysporum y F. solani en otros cultivos hortícolas de interés económico en Andalucía. Además, se propone el uso de agentes de control biológico como medidas de control alternativas al uso de productos químicos. Todas estas medidas están encaminadas a ofrecer una mayor garantía fitosanitaria del material vegetal y a reducir las pérdidas económicas causadas por la infección de estos patógenos en el cultivo de la fresa.