Tesis (Bioquímica y Biología Molecular)

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Biomonitorización de contaminantes ambientales en parejas madre-hijo y posibles asociaciones con su estado de salud y nutricional en el momento del parto
(2024-03-21) Dahiri Khattabi, Bouchra; Bautista Palomas, Juan Dionisio; Moreno Navarro, Isabel María; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular; Universidad de Sevilla. Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal
La exposición humana a contaminantes emergentes es una realidad cada vez más evidente. Las múltiples rutas por las que se puede producir la exposición a estos compuestos y los diferentes mecanismos de acción que pueden generar supone un punto más de complicación en las consecuencias que puede tener sobre la salud. El embarazo y el desarrollo fetal suponen una etapa especialmente sensible en la exposición a estos compuestos, debido a las posibles consecuencias que podría llegar a tener sobre la salud de la madre durante este periodo y sobre el correcto desarrollo del recién nacido. En este punto entra en juego, además, el estilo de vida de las mujeres, pudiendo suponer un riesgo adicional, ya que la exposición a algunos de estos contaminantes emergentes se puede producir a través de la alimentación o el consumo de tabaco, por ejemplo. La biomonitorización humana es una herramienta muy útil en la obtención de información sobre la exposición humana a sustancias químicas, permitiendo de este modo el desarrollo de técnicas para la protección de la salud. Esta herramienta se puede usar para poder conocer tanto los niveles de exposición individuales como los de la población general, haciendo especial incidencia en el caso de poblaciones vulnerables como son las mujeres embarazadas. Con estos precedentes, el objetivo principal de nuestro estudio fue la biomonitorización de contaminantes ambientales (metales y parabenos) en una cohorte de parejas de mujeres embarazadas-recién nacido residentes en Sevilla y provincia y la determinación del estado oxidativo con el fin de relacionarlo con el estado de salud y las características antropométricas de los recién nacidos y sociodemográficas de las participantes. Para abordar el estudio se llevó a cabo una búsqueda del estado del arte de los estudios de exposición a plaguicidas en poblaciones femeninas rurales y urbanas, reflejado en el capítulo 1: “Impact of Pesticide Exposure among Rural and Urban Female Population. An Overview”. Además, se realizó una determinación de los niveles de metales en sangre materna y de cordón, reflejada en el capítulo 2: “Monitoring of metals and metalloids from maternal and cord blood samples in a population from Seville (Spain)” y una determinación de los niveles de parabenos en muestras de orina y de líquido amniótico que aparece en el capítulo 3: “Determinación y cuantificación de los niveles de parabenos en muestras de orina materna y líquido amniótico recogidas en el momento del parto en una población de Sevilla (España)”. Los dos últimos capítulos reflejan una determinación del estado oxidativo de nuestra cohorte en “Assessment of the oxidative status in mother-child couples from Seville (Spain): A prospective cohort study” y finalmente, un estudio de niveles de vitamina D y características de consumo de alimentos de las mujeres: “Niveles de vitamina D en sangre materna y su relación con el consumo de pescado y los parámetros antropométricos de los recién nacidos en una cohorte de parejas madre/hijos de Sevilla”. Los resultados corroboran el paso de estos contaminantes y/o sus metabolitos hacia el feto, a través de la barrera placentaria, siendo en nuestra cohorte, los niveles detectados no tóxicos para la mujer y el recién nacido, cuando se interpretan los resultados de forma aislada. Es por ello, que consideramos que sería necesario continuar este estudio para determinar las posibles consecuencias de una exposición crónica y no solo de compuestos aislados, sino de sus mezclas.
Caracterización de los sistemas gabaérgico y colinérgico en neocorteza de ratones transgénicos modelos de la enfermedad de Alzheimer
(2005-07-22) Río Valencia, Juan Carlos del; Ruano Caballero, Diego; Vitorica Ferrández, Francisco Javier; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
Caracterización del modelo condicional neuronal de caspasa 3 en condiciones fisiológicas y patológicas
(2022-12-02) Roca Ceballos, María Angustias; Ruiz Laza, Rocío; Venero Recio, José Luis; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
La caspasa 3 (casp 3) es una proteasa ampliamente conocida por su papel clave como mediadora en la apoptosis neuronal. En la actualidad, se han puesto de manifiesto funciones de la casp 3 en el Sistema Nervioso Central (SNC) no relacionadas con la apoptosis, destacando su papel regulador en la neurogénesis y en la actividad sináptica. De esta manera, la función de la casp 3 no se reduciría al proceso de apoptosis, sino que la activación limitada de la casp 3 sería crítica para la función sináptica en el cerebro adulto sano, participando en la regulación de la plasticidad sináptica y en los mecanismos moleculares del aprendizaje y la memoria. Las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA) están caracterizadas por la pérdida selectiva de poblaciones neuronales específicas, lo que a su vez desencadena la aparición de déficits cognitivos y/o motores. Además, varias proteínas relacionadas con la EA (APP, presenilinas) son procesadas por la casp 3 y por ello, en la actualidad, se postula que el procesamiento de estas proteínas por parte de la casp 3 podría estar directamente relacionado tanto con el inicio de la enfermedad, como con la ejecución final de la apoptosis neuronal (D´Amelio y cols. 2010). La casp 3 también ha sido relacionada con el incremento de la producción del péptido Aβ (Beta-amiloide), contribuyendo así a la patogénesis asociada a la EA (Tesco y cols. 2007). El objetivo principal de esta tesis ha sido la generación de un modelo murino condicional neuronal de casp 3 que nos permitiese estudiar la implicación de esta caspasa en la plasticidad sináptica en el SNC y con él, que pudiésemos generar una línea de ratones en la que poder estudiar la implicación de la casp 3 en la EA. Para ello, una vez que conseguimos desarrollar nuestro modelo KO condicional de casp 3, se comprobó a través de un análisis funcional y una caracterización conductual, que estos ratones no presentaban ninguna anomalía excepto en la memoria a largo plazo. Tras estos resultados, mediante la realización de la tinción de Golgi-Cox de las espinas dendríticas, se observó que nuestro modelo murino presentaba diferencias en la densidad de las espinas dendríticas y en el porcentaje de cada tipo de espina, presentano menor porcentaje de espinas cortas (maduras) y mayor porcentaje de espinas largas y delgadas (inmaduras). Finalmente, se estudió a través de técnicas electrofisiológicas, cómo la potenciación a largo plazo (LTP) se encontraba inhibida en esta línea de ratones. Estos resultados sugieren que la casp 3 tendría un papel fundamental en los procesos de aprendizaje y memoria, afectando a la LTP y a la plasticidad de las espinas denríticas. Además, habríamos conseguido un modelo murino condicional neuronal de casp 3 que alcanza la edad adulta y no presenta cambios neuropatológicos, pudiendo ser la base de estudios futuros sobre la influencia de la casp 3 en la plasticidad sináptica y sobre los mecanismos moleculares que provocan dichas alteraciones. En el ratón KO condicional de casp 3 APP/PS1, se comenzó comprobando, al igual que en el primer modelo, a través de una pequeña batería de comportamiento, que no existían anomalías que tuvierámos que tener en cuenta a lo largo del estudio. En este caso nos centramos en el análisis de la implicación de casp 3 en la generación de las placas de AB y en el estudio de la microglía presente en ratones de 6 meses. Para ello, analizamos a través de una inmunofluorescencia de triple marcaje, distintos parámetros morfológicos de las placas de A además del porcentaje de microglía por área de A, sin obtener resultados significativos en estos casos. Estudios a edades más avanzadas serían necesarios para completar el análisis de la influencia de casp 3 en la EA.
Papeles no apoptóticos de las caspasas en la neurogénesis hipocampal y el desarrollo embrionario de la microglía
(2022-11-18) Alonso Bellido, Isabel María; Ruiz Laza, Rocío; Venero Recio, José Luis; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
Debido al aumento de la esperanza de vida, existe cada vez una mayor prevalencia de enfermedades neurodegerativas que, junto con su frecuente etiología desconocida, puede llegar a ser un problema socioeconómico y sanitario de alta importancia. Por ello, todos los esfuerzos actuales se están centrando en la búsqueda de dianas biológicas que permita, al menos, mejorar la calidad de vida de los pacientes y, evitar el avance de estas enfermedades. Cada vez son más las evidencias de la implicación de la activación sostenida de la microglía, las células inmunes del cerebro, en el desarrollo de estas patologías neurodegenerativas. Por todo esto, nuestro grupo, además de estudiar mecanismos de control de la función microglial, tiene también como objetivo el estudio de las funciones más allá de la apoptosis de las Caspasas, clásicamente asociadas a esta función de muerte. Entre las funciones no apoptóticas, se ha identificado el papel de estas proteínas como moduladoras de la función microglial, y con ello, una posible herramienta de control para regular la activación de la microglía. Con estos precedentes, el objetivo principal de este estudio fue investigar dos modelos murinos carentes de Caspasa 8 y de Caspasa 3, con el planteamiento específico de estudiar qué papel jugaban dichas proteín cinasas en el desarrollo embrionario de la microglía y en la neurogénesis hipocampal adulta, respectivamente. El desarrollo embrionario es un periodo de potente recambio celular, en el que, para garantizar la correcta homeostasis, no solo es necesaria la formación de nuevas células y conexiones, sino también mantener activas las vías de muerte. Es ahí, donde entra en juego la Caspasa 8, no solo en el inicio de la vía extrínseca de la apoptosis si no también en la regulación de la necroptosis, otra vía de muerte reconocida fisiológica. Más allá de los papeles pro-apoptóticos de la Caspasa 8, queda claro su función pro-supervivencia debido a que su ausencia genera, de media, la muerte en la etapa embrionaria E10.5. Tras corroborar las evidencias publicadas en los sujetos carentes de Caspasa 8, procedimos a estudiar el estado de la microglía, obteniendo un descenso significativo de los niveles de microglía tanto homeostática como reactiva a E13.5. Los datos mostrados hacen pensar que no es debido a un problema de migración desde el saco vitelino, sino que todo apunta a un problema en la supervivencia y proliferación, no solo de la microglía sino de las neuronas. La neurogénesis hipocampal adulta (NHA) es un proceso implicado en numerosas enfermedades neurodegenerativas. Muchos investigadores han descrito la microglía como un componente clave en la regulación de la formación y migración de nuevas neuronas a lo largo de la corriente migratoria rostral. El segundo objetivo principal de este trabajo es identificar el papel de la Caspasa 3 en las funciones microgliales relacionadas con la neurogénesis. Para abordar este estudio, se utilizaron ratones mutantes condicionales de Caspasa 3 en la línea celular de microglía. Con esta herramienta, queríamos dilucidar el papel de esta proteína en la función microglial en el hipocampo, la principal región donde tiene lugar la neurogénesis adulta. Tras la supresión de la Caspasa 3 en la microglía, los ratones mutantes mostraron una reducción de la microglía en el hipocampo, mostrando una morfología menos activa. Mediante el análisis de imágenes de alta resolución, también observamos una reducción de la capacidad fagocítica de la microglía carente de Caspasa 3. Además, encontramos una reducción de las neuronas neurogénicas en los ratones knockout de Caspasa 3. El análisis conductual mediante pruebas de reconocimiento de objetos y de laberinto en Y mostró una alteración de la memoria y el aprendizaje en ausencia de la Caspasa 3 microglial. En conjunto, estos resultados mostraron el papel esencial de la Caspasa 3 en la función microglial y destacan el papel relevante de este fenotipo microglial específico en el mantenimiento de la NHA en el hipocampo. Por todo ello, podemos seguir aportando nuevas pruebas de las funciones más allá de la apoptosis de estas proteín quinasas y con ello, esperanzadoras herramientas que nos permitan controlar la activación microglial y las consecuencias de las enfermedades a las que se ha ido asociando.
Diseño de bioprocesos de economía circular de bioestimulantes ambientales a partir de Okara
(2022-10-28) Orts Gómez, Ángel; Parrado Rubio, Juan; Caballero Jiménez, Pablo; Tejada Moral, Manuel; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular; Universidad de Sevilla. Departamento de Cristalografía, Mineralogía y Química Agrícola
La tesis tiene como objetivos el desarrollo de bioprocesos de obtención de bioestimulantes ambientales mediante tecnología hidrolíticas y fermentativa a partir de un subproducto de la industria alimentaria la OKARA y su caracterización funcional. Los nuevos productos desarrollados entran en la categoría de bioestimulantes ambientales, con aplicaciones principalmente agrícolas, estos incluyen diversas formulaciones de compuestos, sustancias y microorganismos que se aplican a plantas o suelos para regular y mejorar los procesos fisiológicos del cultivo, haciéndolos más eficientes. Los bioestimulantes actúan sobre la fisiología de las plantas a través de diferentes vías que los nutrientes para mejorar el vigor del cultivo, los rendimientos, la calidad y la vida útil/ conservación después de la cosecha Esta tesis doctoral se compone de 4 capítulos. En el primer capítulo se realiza el diseño de los bioprocesos de obtención a partir de okara, mediante tecnología hidrolítica y fermentativa. La okara es un subproducto industrial con una interesante composición orgánica, pero su principal problema para tener una funcionalidad como bioestimulante edafológico es la baja biodisponibilidad de sus biomoleculas, especialmente de las proteínas. La valorización de este subproducto mediante su conversión en productos de alto valor añadido para su uso en agronomía se ha llevado utilizando dos tipos tecnologías biológicas: Enzimático y fermentativo, obteniéndose dos tipos de bioestimulantes En el segundo capítulo se realiza una evaluación el potencial bioestimulante edafológico de los bioestimulantes obtenidos a partir de Okara sobre los microorganismos del suelo y, a nivel bioquímico, en particular, las actividades enzimáticas vinculadas a los ciclos biogeoquímicos, la diversidad microbiana y la influencia en la biodiversidad microbiana. Respecto a la aplicación de los productos en suelos, destaca una gran estimulación de los microorganismos edáficos tanto en el producto hidrolizado, como en el producto fermentado soluble, postulándolos como buenos candidatos para la formulación bioestimulantes agronómicos ricos en aminoácidos, péptidos y moléculas bioactivas. En el tercer capítulo se estudiará el potencial bioestimulante de un Hidrolizado enzimático de Okara, en la biorremediación de suelos contaminados por el insecticida clorpirifos. El potencial bioestimulante será evaluado taete-a nivel de influencia en las propiedades biológicas. A partir de los resultados obtenidos sobre el potencial de biorremediación del bioestimulante de okara aplicado a suelos contaminados por clorpirifos se puede concluir que: Los bioestimulantes a partir de la okara aplicados a los suelos presentan un gran potencial para la biorremediación de suelos contaminados por clorpirifos, aumentando considerablemente la degradación del contaminante en los suelos. Las actividades enzimáticas en las muestras con aplicación del bioestimulante con clorpirifos, demostró una rápida degradación del contaminante, situándose a los 7 días la mayor tasa de eliminación. Los mayores valores de biorremediación se obtuvieron en el producto hidrolizado de la okara, debido su contenido en proteínas de bajo peso molecular soluble fácilmente asimilable por los microorganismos del suelo, siendo así una buena alternativa para la biorremediación de suelos contaminados por clorpirifos. del suelo, y específicamente en la degradación del xenobiótico. Finalmente, en el capítulo 4, se evaluará la potencia bioestimulante del Biestimulante enzimático de okara frente en el estrés ambiental por ozono. Este revirtió la disminución inducida por ozono en parámetros fisiológicos como tasa fotosintética neta, contenido de clorofila y evaluación de la fluorescencia directamente en hoja, y detuvo la oxidación de biomoléculas en hojas. Por lo tanto, los resultados de nuestro estudio 5 destacan el uso potencial de los bioestimulantes de okara, como un protector vegetal eficaz contra el estrés oxidativo causado por el Ozono. Así, contribuimos a los esfuerzos generales realizados en la última década en la búsqueda de nuevos productos alternativos no químicos para proteger los cultivos contra los daños causados por el estrés oxidativo ambiental.
Posible papel diferencial de la autofagia en respuesta al estrés proteico en microglía y neuronas
(2022-03-18) Domínguez Martín, Helena; Ruano Caballero, Diego; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
En esta tesis doctoral hemos afrontado el estudio de mecanismos implicados en el mantenimiento de la proteostasis en dos tipos diferentes de células del sistema nervioso: microglía y neuronas. Para ello, se ha usado un modelo de estrés proteotóxico basado en la acumulación de proteínas tras el bloqueo del proteasoma con MG132, un inhibidor reversible del proteasoma. Los resultados más relevantes muestran que, tanto los mecanismos implicados como la respuesta al estrés, son diferentes en los dos tipos celulares. Por una parte, el bloqueo del proteasoma induce un estrés celular que se manifiesta como estrés de retículo endoplasmático (RE), lo que provoca la activación de la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR, por sus siglas en inglés). La UPR se trata de una respuesta homeostática, que trata de mitigar la situación de estrés y/o inducir la muerte celular por apoptosis cuando el daño resulta excesivo. Las neuronas muestran una activación de la UPR rápida, completa y eficiente, activándose especialmente la vía de IRE1-sXbp1 (con carácter de pro-supervivencia), que a su vez promueve una rápida recuperación de la homeostasis y bajos niveles de muerte celular. Por otra parte, la microglía presenta una activación de la UPR poco eficiente, especialmente de la vía IRE1-sXbp1, mientras que la vía de PERK-CHOP se activa de manera intensa y sostenida en el tiempo. Esta vía tiene un carácter pro-apoptótico, por lo que su activación en la microglía conlleva la apoptosis temprana y masiva de estas células. Otro elemento objeto de estudio durante este trabajo ha sido la relación funcional entre el proteasoma y la autofagia. Resulta esencial la cooperación entre ambos sistemas de degradación de proteínas para la supervivencia celular en un ambiente de estrés proteico, como ya ha sido demostrado por este grupo en estudios tanto in vitro como in vivo. En este caso, nuestros resultados muestran que las células microgliales tienen un mayor flujo autofágico basal que las neuronas. Sin embargo, en un contexto de estrés proteico, las neuronas presentan un rápido, aunque suave, aumento de este flujo que resulta suficiente para eliminar las proteínas poli-ubiquitinadas. Por el contrario, la microglía no es capaz de degradar las proteínas poli-ubiquitinadas, que se van acumulando a lo largo del tiempo, a pesar de que se produce un fuerte aumento del flujo autofágico de manera lenta. Esto nos lleva a pensar que la activación de la autofagia en la microglía no sucede como respuesta a la inhibición del proteasoma, sino frente a otro estímulo. Puesto que uno de los principales propósitos de la microglía es la fagocitosis, y teniendo encuenta que ciertos estudios indican que existe una contribución de la autofagia microglial a la degradación de los residuos de A, -sinucleína y mielina (característicos de las enfermedades de Alzheimer, Parkinson y ELA, respectivamente) tras su inclusión en los fagosomas desde el medio extracelular, proponemos que el estímulo activador de la autofagia microglial es la autofagocitosis de las mismas células microgliales que están muriendo debido al estrés de RE que se ha mencionado previamente. Por último, también hemos estudiado el estado de activación de diferentes vías que podrían estar implicadas en la activación de la autofagia. En general, nuestros datos muestran claramente que existen diferencias en el estado de activación de estas vías en ambos tipos celulares. Por un lado, la vía de mTORC1 se encuentra activa en las neuronas a lo largo de todo el tiempo ensayado, lo cual es compatible con una actividad autofágica continuada, mientras que en la microglía esta activación aparece retrasada en el tiempo y es de corta duración, lo que concuerda con el comportamiento de la autofagia en estas células. Además de esto, la vía AKT/GSK-3/-catenina también muestra un comportamiento diferencial. En las neuronas, AKT parece estar activado por la vía PI3K/PDK1, mientras que en la microglía esta vía se encuentra inhibida, siendo AKT activado en este caso por la vía mTORC2. Al estudiar el estado de fosforilación de AKT, encontramos que se encuentra fosforilado en distintos residuos dependiendo del tipo celular, lo que se asocia con una diferente selección de sustrato. De hecho, aunque AKT está activa en ambos tipos celulares, GSK-3 se encuentra activa en la microglía a lo largo de todo el tiempo ensayado, mientras que en las neuronas se encuentra inhibida de manera temporal, al tiempo que FOXO3 se mantiene activo en las neuronas y se inhibe en la microglía. Por último, la proteína -catenina (efectora de la vía Wnt/-catenina) también muestra comportamientos diferentes en función del tipo celular. En las neuronas no se detecta activación de esta vía, lo que nos lleva a pensar que la -catenina se está degradando a través de la autofagia. Por el contrario, en la microglía se produce una acumulación tiempo dependiente de esta proteína, lo que sugiere que se está dando la activación canónica de la vía Wnt/-catenina. Además, esta vía es capaz de modular la autofagia, por lo que podemos estar observando un mecanismo regulador de la autofagia respecto al material a degradar. En su conjunto, los datos obtenidos a lo largo de este trabajo se pueden interpretar desde un punto de vista evolutivo en cuanto a que las neuronas son células post-mitóticas, diferenciadas y sin capacidad proliferativa. Por ello, resulta razonable que las vías activas se centren en la degradación del material intracelular acumulado, mejorando así los niveles de estrés y permitiendo la supervivencia neuronal. Por su parte, las células microgliales presentan capacidad proliferativa, y su función es la de vigilar el medio extracelular, eliminando los agentes patógenos o citotóxicos del parénquima cerebral. De esta forma, resulta probable que los esfuerzos en estas células se centren en degradar el material extracelular capturado por fagocitosis, dejando en un segundo plano la supervivencia celular. Nuestros resultados son compatibles con estudios en pacientes de la enfermedad de Alzheimer donde se observa degeneración microglial, la cual es paralela al avance de los estadios Braak de esta patología. En resumen, nuestros resultados ponen de manifiesto diferencias significativas tanto a nivel molecular como funcional entre la microglía y las neuronas en respuesta al estrés proteico. En concreto, la función de la autofagia es diferente en ambas líneas celulares, así como la activación de diversas vías de señalización que pudieran estar regulando esta diferencia funcional. Además, este trabajo deja abierta diversas líneas de investigación, tales como determinar de manera exacta la/s vía/s de señalización de la activación de la autofagia en ambos tipos celulares en respuesta al estrés proteico, o evaluar el papel de la proteína quinasa AKT en la regulación de la autofagia canónica y no canónica.
Terapias avanzadas para enfermedades degenerativas de la retina
(2021-06-01) García Delgado, Ana Belén; Díaz Corrales, Francisco Javier; Bhattacharya, Shomi S.; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
Las enfermedades degenerativas de la retina (EDR) son un grupo heterogéneo de patologías, algunas hereditarias y otras con un origen complejo, que producen una pérdida progresiva de las células de la retina con la consiguiente pérdida de la agudeza visual pudiendo avanzar hasta producir una ceguera total. En los últimos años y gracias al desarrollo de terapias avanzadas como la terapia génica y celular muchos casos de ceguera podrían ser potencialmente tratables. El descubrimiento de las células madre de pluripotencia inducida o iPSC ha aportado una fuente celular ilimitada con gran potencial ya que gracias a sus propiedades son un instrumento prometedor para el estudio de enfermedades, así como para ser utilizadas en medicina regenerativa e ingeniería tisular. La edición génica es una novedosa tecnología con la se puede manipular con precisión una secuencia del genoma humano para lograr un efecto terapéutico mediante la cual se pueden corregir mutaciones que causan enfermedades, añadir genes terapéuticos a sitios específicos del genoma y eliminar genes letales o secuencias del genoma. En este trabajo se han generado y caracterizado con éxito dos líneas de iPSC a partir de muestras de sangre periférica de pacientes con EDR, como son la degeneración macular asociada a la edad (DMAE) y la retinosis pigmentaria (RP), con el fin de establecer modelos celulares de cada una de las enfermedades y terapia celular de reemplazo. Estas líneas nos han permitido conocer las bases celulares y moleculares que llevan al desarrollo de la enfermedad. Posteriormente, enfocándonos en la medicina regenerativa, con el objetivo de buscar nuevas terapias para tratar a pacientes con DMAE, las iPSC fueron diferenciadas hacia células de epitelio pigmentario de la retina (EPR). Las células obtenidas fueron caracterizadas y trasplantadas en diferentes modelos animales. Se demostrado que las células de EPR sobreviven y mantienen su fenotipo y orientación sin ningún efecto adverso local o sistémico. Por último, en la línea de iPSC obtenida de la muestra de sangre periférica de un paciente con RP causada por una mutación en el gen EYS, se ha pretendido corregir la mutación mediante el uso de CRISPR/Cas9. En este caso aunque se corrigió la fase de lectura en el alelo mutante, no se logró obtener la misma secuencia presente en el alelo silvestre.
La gliceraldehido-3-fosfato dehisdrogenasa no fosforilante de los eucariotas fotosintéticos: distribución, regulación y función fisiológica
(1995-07-01) Mateos Matos, María Isabel; Serrano Delgado, Aurelio; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
La g3p dhasa no fosforilante dependiente de nadp+ es un enzima citosólico que se encuentra presente en organismos fotosintéticos eucarióticos. Los niveles celulares de las tres actividades g3p dhasas de microalgas aumentan en cultivos fotoautotróficos hasta niveles máximos debido a síntesis de novo de proteínas, manteniéndose constante en la oscuridad. La presencia de azucares metabolizables, la ausencia de co2 y las condiciones microaeróbicas provocan una drástica caída de la actividad g3p dhasa cloroplástica hasta valores indetectables. En cambio, los azúcares provocan un aumento en los niveles de las g3p dhasas citosólicas. Estos patrones de regulación permiten sugerir un papel para la g3p dhasa no fosforilante, alternativo al propuesto en fotosíntesis en el metabolismo degradativo de carbohidratos. La purificación del enzima de c. Reinhardtii ha permitido realizar estudios in vitro sobre su capacidad de generación de protones y su participación en el transporte de los mismos desde el cloroplasto al citosol.
Evaluación de la influencia de la exposición laboral a fitosanitarios en mujeres que recogen verduras: posibles consecuencias sobre su salud
(2021-04-14) Martín Reina, José; Moreno Navarro, Isabel María; Bautista Palomas, Juan Dionisio; Universidad de Sevilla. Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
Una de las misiones fundamentales de la figura del Técnico Superior de Prevención de Riesgos Laborales es preguntarse si, en ambientes laborales donde la exposición a distintos tipos de productos es indirecta, dicha exposición está controlada y, lo más importante, si esta exposición indirecta no afecta a la salud de los trabajadores. Situaciones donde hacernos esta pregunta las encontramos en diferentes campos, como en el caso del presente estudio donde nos hemos centrado en la exposición laboral indirecta a plaguicidas. Conocedores de la amplia normativa y documentación que ya existe sobre la peligrosidad de la exposición directa a plaguicidas, relativa principalmente a los trabajadores que los aplican, hemos querido extender el estudio a los posibles efectos adversos de la exposición indirecta a plaguicidas en una población de mujeres agrícolas que recogen verduras en el campo, a “cielo abierto”. El objetivo principal de este estudio ha sido el de comprobar si las trabajadoras que recogen verduras y frutas en el campo a “cielo abierto” ven alterados sus parámetros biológicos, y en consecuencia su estado de salud, a consecuencia de la aplicación previa de fitosanitarios en los productos recogidos. Para conseguir este objetivo principal nos hemos apoyado en varios objetivos secundarios (hemos realizado un análisis sobre los mecanismos tóxicos de los plaguicidas, hemos comprobado, en qué estado se encontraban los valores clínicos, valores renales y estrés oxidativo de las trabajadoras con las que hemos llevado a cabo el estudio, hemos validado un método para determinar glifosato en orina, hemos determinado valores de glifosato en orina y metales en sangre). Entre los resultados obtenidos, cabría destacar que, las transaminasas y las colinesterasas no se ven afectadas, sin embargo sí resultan afectados otros marcadores como son los de estrés oxidativo, daño renal temprano y hormonas relacionadas con la reproducción, y, es por esto que, consideramos que la normativa y protocolos españoles, son insuficientes para garantizar la salud de las trabajadoras, así como también son insuficientes para garantizar una fertilidad y desarrollo adecuado de la descendencia de las trabajadoras.
Variaciones de la respuesta microglial según el contexto patológico en la Enfermedad de Alzheimer
(2021-04-30) Romero Molina, Carmen; Vitorica Ferrández, Francisco Javier; Vizuete Chacón, María Luisa; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
La Enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo progresivo e irreversible que conlleva un deterioro de las funciones cognitivas, afectando a 35 mill de personas a nivel mundial. Las lesiones histopatológicas principales son las placas seniles (placas de Abeta) y los ovillos neurofibrilares (agregaciones intracelulares de Tau). Además, se registra pérdida neuronal y un proceso neuroinflamatorio mediado por las células gliales (astrocitos y microglía). Los continuos fracasos terapéuticos, principalmente enfocados en la hipótesis de la cascada amiloide, señalan la necesidad de identificar nuevas dianas terapéuticas. Recientes análisis genéticos han demostrado que ciertos polimorfismos en genes implicados en la función microglial aumentan el riesgo de padecer la EA, resaltando la importancia de la neuroinflamación en la patología. Dado que el papel de la microglía en la progresión de la enfermedad no se conoce con exactitud, el objetivo de este trabajo es caracterizar la variabilidad fenotípica y funcional de la microglía en la EA. Para ello, hemos utilizado modelos celulares y animales y muestras de pacientes de Alzheimer. En los diferentes ensayos, hemos empleado técnicas bioquímicas, transcriptómicas, metabolómicas, de imagen y de citometría de flujo. Nuestros resultados muestran que, en presencia de patología Abeta, la microglía se activa y rodea las placas amiloides. Sin embargo, en presencia de patología Tau, la microglía adquiere bien un fenotipo degenerativo (regiones hipocampales del cerebro de pacientes y ensayos in vitro con fracciones solubles procedentes de animales ThyTAU22), o bien un fenotipo reactivo (modelo TAU P301S), que depende del grado de fosforilación y agregación de las formas de Tau. Centrándonos en la microglía activa, hemos identificado que adquiere un fenotipo asociado a neurodegeneración y un metabolismo oxidativo, mediado por TREM2. Este metabolismo aerobio es esencial para sustentar una activación microglial crónica, y se altera por una disminución de la disponibilidad de oxígeno o pérdida de función de TREM2. En modelos murinos, la hipoxia impide la activación microglial, lo que implica un empeoramiento de la patología Abeta, pero una mejora de la tauopatía, sugiriendo que la microglía podría presentar un papel dual. Sin embargo, en muestras de enfermos de Alzheimer, la hipoxia conlleva una disfunción microglial que incrementa la patología neuronal, otorgando a estas células un papel más beneficioso que perjudicial. Con el objetivo de estudiar la progresión de la enfermedad en un contexto de disfunción microglial, hemos desarrollado un modelo murino doble transgénico que nos permite realizar una ablación reversible de células microgliales. Hemos realizado una caracterización inicial del modelo, evaluando la eficacia de depleción, la posterior capacidad de repoblación y la activación microglial tras periodos agudos y crónicos de depleción. La elevada capacidad de recambio microglial murina nos lleva a cuestionarnos su validez como un modelo que mimetice la disfunción microglial en humanos, pero permite valorar la progresión de la patología de Alzheimer en un contexto de renovación microglial. Por tanto, proponemos que el metabolismo oxidativo microglial, mediado por TREM2, es fundamental para la activación crónica de estas células. En pacientes de Alzheimer, distintas alteraciones génicas y/o problemas vasculares podrían comprometer la respuesta microglial y originar un fenotipo distrófico. En conclusión, en cerebros de pacientes de Alzheimer podría existir una elevada variabilidad en la respuesta microglial dependiendo del grado de desarrollo de las patologías Abeta y Tau y de otras comorbilidades de los pacientes. Todo ello debe ser tenido en cuenta a la hora de proponer nuevas dianas terapéuticas más eficaces.
Implicación de la disfunción glial en la evolución de la patología en pacientes de Alzheimer
(2021-01-20) Muñoz Castro, Clara; Vitorica Ferrández, Francisco Javier; Vizuete Chacón, María Luisa; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
La enfermedad de Alzheimer (EA) es un proceso neurodegenerativo que cursa con un deterioro progresivo de las funciones cognitivas, llegando a ser una enfermedad altamente incapacitante. Actualmente, uno de los principales retos biomédicos a los que se enfrenta nuestra sociedad es el desarrollo de terapias que frenen o, al menos, retrasen la progresión de esta patología. Los continuos fracasos terapéuticos, basados principalmente en la hipótesis de la cascada amiloide, han promovido el desarrollo de hipótesis alternativas en las que la respuesta inmune, tanto central (mediada por microglía y astrocitos) como periférica, desempeña un papel fundamental en el desarrollo de la enfermedad. En esta línea, planteamos definir la firma molecular de microglía y astrocitos en pacientes de Alzheimer, así como caracterizar su heterogeneidad morfológica, regional y funcional, y, además, determinar si se produce infiltración de células inmunes periféricas en el sistema nervioso central de dichos pacientes. Para ello, hemos empleado técnicas bioquímicas, transcriptómicas y de imagen en muestras post mortem de hipocampo y corteza frontal de pacientes de Alzheimer, así como estudios in vitro y en modelos animales con patologías amiloide y neurofibrilar. Nuestros resultados en humanos reflejan que, en la corteza frontal se produce una acumulación de Aβ más severa y temprana que en el hipocampo. En ambas regiones existe una degeneración importante de neuronas PV+, probablemente mediada por la patología Tau y el sistema del complemento. También observamos que la respuesta microglial es distinta en las dos regiones estudiadas; en la corteza frontal de pacientes de Alzheimer no se produce, como en el hipocampo, una disminución en la población microglial, pero sí una alteración hacia un fenotipo activo que podría estar mediado por formas de Aβ. Con relación a los astrocitos, proponemos que las especies solubles de Aβ y/o Tau participan en el desarrollo de un fenotipo disfuncional, que se manifiesta con un perfil transcripcional reactivo e hipometabólico. Como consecuencia, la protección astroglial es menor, y se activa la respuesta del complemento, reforzando la hipótesis de que la disfunción astroglial podría estar implicada en las deficiencias sinápticas y la neurodegeneración asociadas a la EA. Para profundizar en la firma molecular de microglía y astrocitos en la EA, hemos desarrollado una novedosa aproximación experimental que nos ha permitido estudiar, por primera vez, hasta 17 marcadores gliales diferentes en una misma sección de tejido de pacientes de Alzheimer, de forma cuantitativa, con elevada resolución, y sin perder la celularidad, morfología y distribución espacial. Por otra parte, demostramos que en el parénquima cerebral de pacientes de Alzheimer se produce infiltración de CDM. Esta infiltración está asociada a una patología más severa, y parece ser consecuencia de diversos factores, entre los que destacamos la alteración en la función glial y vascular, el reclutamiento a través del eje CCL2/CCR2 y la transmigración a través de la BHE. En conclusión, proponemos que en pacientes de EA se produce una importante disfunción glial, caracterizada por un aumento en la respuesta reactiva y neurotóxica, pero sobre todo por una disminución en las funciones homeostáticas y protectoras. Este hecho podría facilitar junto a otros factores, la infiltración de CDM. Por tanto, postulamos que la disfunción glial es un mecanismo patogénico fundamental en la EA, y una potencial herramienta terapéutica.
Análisis comparado en animales y plantas de la función del citocromo c respiratorio en el proceso de muerte celular programada
(2008-06-13) García Heredia, José Manuel; Rosa Acosta, Miguel Ángel de la; Navarro Carruesco, José Antonio; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis
Análisis geoquímico-orgánico de sedimentos del estuario del río Guadiana y su relación con la detección de cambios ambientales en el holoceno
(2003-07-18) Polvillo Polo, Oliva; González Vila, Francisco Javier; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
El estudio de las condiciones ambientales y de los procesos biogeoquímicos que gobiernan la preservación de la materia orgánica (MO) en sedimentos de estudarios tiene un especial interés por las peculiares características de este medio sedimentario. En las zonas semi-cerradas y de interfase de los estuarios, se produce una rápida acumulación de sedimentos finos procedentes tanto del ambiente marino y terrestre, y que están ac cesibles a los procesos de alteración microbiana. Tanto la diversidad de los aportes, como los periodos de fluctuaciones climáticas y del nivel del mar que tuvieron lugar en épocas geológicas pueden quedar registrados en las características del a MO depositada en los sedimentos estuarinos. Con estas premisas, en el presente trabajo de investigación se ha llevado a cabo el estudio geoquímico-orgánico de un core sedimentario de 53m de profundidad del estuario del río Guadiana. Dicho estudio ha consistido en la determinación de parámetros geoquímicos de caracterización global en 32 secciones del core, y en el estudio molecular de biomarcadores presentes en las fracciones de lípidos (mediante GC-MS) y macromoléculas (por técnicas espectroscópicas y degradativas) aislados a lo largo del perfil sedimentario. Los objetivos básicos del estudio fueron la descripción de la naturaleza de los aportes orgánicos a lo largo del perfil, de las condiciones paleoambientales en el momento de la deposición, y de las alteraciones diagenéticas, para contribuir a la reconstrucción de los cambios climáticos y ambientales producidos en una escala temporal reciente (Holoceno). De los resultados obtenidos cabe resaltar dos conclusiones principales: 1,- Se corrobora la validez del "proxy" geoquímico-orgánico para estudios paleoclimáticos en épocas recientes, como complemento a las aproximaciones convencionales, principalmente estudios geológicos, palinológicos y de distribución de diferentes tipos de o
Mecanismo de regulación postraduccional de la glutamina sintetasa de tipo I en cianobacterias
(2008-09-25) Verónica Galmozzi, Carla; Florencio Bellido, Francisco Javier; Muro-Pastor, María Isabel; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología
Proteins influencing the septal junctions in heterocystous cyanobacteria
(2020-09-17) Arévalo Díaz, Sergio; Flores García, Enrique; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
La multicelularidad es una forma de organización biológica que ha aparecido de forma independiente en muchos grupos filogenéticos a lo largo de la evolución. En los organismos multicelulares se dan universalmente procesos de adhesión, comunicación y diferenciación celular. La multicelularidad se observa en varios grupos bacterianos, estando las cianobacterias entre los organismos multicelulares más antiguos de la Tierra. Las cianobacterias se caracterizan por llevar a cabo la fotosíntesis oxigénica, mediante la cual se produce la liberación de oxígeno y la producción de “poder asimilatorio” (ATP y ferredoxina reducida/NADPH), el cual se usa en la fijación de CO2 atmosférico y en la asimilación de algunos otros nutrientes oxidados. Dentro de este filo se pueden encontrar tanto organismos unicelulares como multicelulares. Aquellas cianobacterias que se comportan como organismos multicelulares crecen formando filamentos, y en condiciones de deficiencia de nitrógeno algunas de ellas pueden dar lugar a un proceso de diferenciación celular produciendo un tipo celular llamado heterocisto. Este último lleva a cabo la fijación de nitrógeno atmosférico (N2), mientras que el resto de las células del filamento, denominadas células vegetativas, continúan con la fijación de CO2. Otras especies del filo tienen la capacidad de formar aquinetos, que son una forma celular de resistencia que aparece en algunas cianobacterias cuando las condiciones ambientales se vuelven adversas, y aún otras forman hormogonios, pequeños filamentos móviles con una función de dispersión. Este trabajo se ha realizado con la estirpe modelo Anabaena sp. PCC 7120, que es una cianobacteria filamentosa formadora de heterocistos. Las cianobacterias poseen una envuelta celular de tipo Gram negativa, y en las cianobacterias filamentosas la membrana plasmática envuelve individualmente a cada célula mientras que la membrana externa, situada por fuera de la capa de peptidoglicano, es continua definiendo por tanto un periplasma continuo. Cuando Anabaena crece en ausencia de nitrógeno combinado, se produce la diferenciación de heterocistos, formándose un patrón a lo largo del filamento de un heterocisto cada 10-15 células vegetativas. El crecimiento diazotrófico exige una comunicación intercelular que permita el intercambio de nutrientes y moléculas reguladoras de la diferenciación a lo largo del filamento, llevándose a cabo esta comunicación a través de los nexos septales. Estos son unas estructuras proteicas que comunican de forma directa las células adyacentes. Actualmente se conocen algunas proteínas que forman parte de los nexos septales como son FraC y FraD, y algunas otras que son esenciales para el correcto funcionamiento o ensamblaje de los mismos, como son SepJ, SepI, HglK (demostrada en esta Tesis) o FraE. Para el ensamblaje de los nexos septales es necesario una perforación del peptidoglicano existente entre las células adyacentes del filamento. Estas perforaciones reciben el nombre de nanoporos y se encuentran en el disco septal de peptidoglicano. En la primera parte de este trabajo se intentó establecer una relación entre los nanoporos y la comunicación intercelular mediada por los nexos septales, utilizando como herramientas un marcador fluorescente y diferentes mutantes de Anabaena. El marcador fluorescente utilizado fue la calceína, que posee la propiedad de difundir desde el exterior hasta el interior de la célula, donde sufre un proceso de hidrólisis que le impide volver a atravesar la membrana plasmática, quedando atrapada en el interior de la célula y emitiendo fluorescencia. Por medio de experimentos de FRAP (“Fluorescence Recovery After Photobleaching”) se pudo calcular un indicador cuantitativo de transferencia entre células adyacentes del filamento. Por otra parte, mediante el aislamiento del peptidoglicano y su visualización por microscopía electrónica de transmisión se pudo cuantificar el número de nanoporos de las estirpes estudiadas. Estos ensayos se realizaron en filamentos (cultivados en presencia o ausencia de nitrógeno combinado) de la estirpe silvestre y de mutantes tanto de proteínas que intervienen en la formación de los nexos septales como de proteínas que influyen en su ensamblaje y funcionamiento. Los resultados obtenidos permitieron establecer una correlación entre el número de nanoporos y la transferencia intercelular de calceína en filamentos que habían sido incubados en medio sin nitrógeno combinado, pero no en aquellos incubados en presencia de nitrógeno, en los que se observaba una elevada proporción de células no comunicantes. En la segunda parte de esta Tesis se procedió a la caracterización de la proteína HglK, que pertenece a la familia de las pentapeptide repeat proteins (PRP). HglK se compone de cuatro segmentos transmembrana en su mitad N-terminal y de una sección soluble de localización periplásmica que contiene el dominio PRP en su mitad C-terminal. Estudios previos de HglK mostraron que mutantes que carecían de ella eran incapaces de crecer diazotróficamente y tenían un espacio incrementado entre las células del filamento. En esta Tesis se abordó la localización de HglK en estirpes de Anabaena que producían HglK fusionada a la superfolder-GFP (sfGFP) o con una cola de histidinas o con la etiqueta molecular Strep II. Mediante microscopía confocal y de fluorescencia y ensayos de inmunolocalización, se pudo establecer que HglK poseía una localización preferentemente polar en las células de Anabaena. El estudio de mutantes hglK determinó que HglK es necesaria para la integridad del filamento y para observar unos niveles normales de intercambio molecular entre las células vegetativas del filamento. Sin embargo, los experimentos realizados con mutantes de HglK y de otras proteínas septales mostraron que ni la fragmentación de los filamentos ni la alteración en el intercambio molecular era mayor cuando se combinaba la inactivación de HglK con la de otras proteínas septales. En la caracterización de HglK también se pudo establecer que el fenotipo de crecimiento diazotrófico negativo del mutante hglK estaba determinado por su incapacidad de fijar nitrógeno atmosférico como consecuencia de un defecto en la expresión génica durante la diferenciación de los heterocistos, puesto de manifiesto como una expresión disminuida de los genes del operón cox2 (citocromo oxidasa del heterocisto) y nifHDK (nitrogenasa) en los mutantes hglK. Los avances obtenidos mediante la caracterización de HglK y el conocimiento disponible sobre la proteína SepJ, ponían de manifiesto la implicación de ambas proteínas en los nexos septales. SepJ es una proteína integral de membrana con una localización focalizada en el centro del septo intercelular. SepJ está compuesta por una permeasa en su parte C-terminal y por un linker (rico en el amino ácido prolina) y un dominio coiled-coil en su parte N-terminal, la cual parece ser periplásmica. En el tercer capítulo de esta Tesis se intentó identificar proteínas con las que pudieran tener algún tipo de interacción tanto HglK como SepJ. El abordaje experimental se hizo mediante el uso de estirpes de Anabaena que portaban HglK fusionada a la Strep II o SepJ fusionada a la Strep II o a la GFP. Estas fusiones permitieron la purificación de las proteínas, que se llevó a cabo bajo condiciones no desnaturalizantes, intentando evitar la disgregación de los posibles complejos que pudieran formar con otras proteínas. Las muestras obtenidas tras las purificaciones se analizaron por espectrometría de masas para identificar todas las proteínas presentes en ellas. El análisis de los resultados mostró varias proteínas que podrían interactuar con HglK o SepJ. El primer resultado destacable es la posible interacción entre ambas (SepJ y HglK), aunque la co-purificación de las dos proteínas solamente se observó en los aislados de SepJ. También destaca la presencia de dos proteínas comunes en los aislados de SepJ y HglK. Estas proteínas son Alr2937 y Tic22 (Alr0114), ambas periplásmicas, la segunda de las cuales con un papel importante en la formación de la membrana externa de Anabaena. Finalmente, mientras que no se ha encontrado ninguna proteína que interaccione solamente con HglK, para SepJ se detectó Alr1690, una proteína anclada a la membrana plasmática que presenta dominios periplásmicos de unión al peptidoglicano. Continuando con el estudio de las proteínas septales, se quiso profundizar en el conocimiento de las proteínas SepJ, FraC y FraD de otras cianobacterias filamentosas formadoras de heterocistos, concretamente de cianobacterias simbióticas con diatomeas marinas. En el cuarto capítulo de esta Tesis, se estudiaron estas proteínas septales codificadas por los genes de las cianobacterias Richelia intracellularis (RintHH01) y Calothrix rhizosoleniae (CalSC01). R. intracellularis es un endosimbionte obligado que vive en el citoplasma de la diatomea Hemiaulus hauckii, mientras que C. rhizosoleniae es un exosimbionte facultativo de la diatomea Chaetoceros compressus, pudiendo proliferar anclada extracelularmente a la diatomea o como un organismo de vida libre. En Anabaena, fraC y fraD forman parte del operón fraCDE que también se encuentra presente en CalSC01 y, sólo fraCD, en RintHH01. Respecto a SepJ, tanto RintHH01 como CalSC01 contienen genes que determinan proteínas homólogas a la de Anabaena. Los mutantes sepJ y fraC-fraD de Anabaena muestran un fuerte fenotipo de fragmentación e imposibilidad de crecer diazotróficamente, ambos fenotipos de fácil estudio, por lo que se intentó la complementación de dichos mutantes con los genes de las cianobacterias simbióticas. Los genes sepJ y fraCD de RintHH01 y los genes sepJ y fraCDE de CalSC01 se obtuvieron por síntesis química, en el caso de sepJ de CalSC01 con un uso de codones adaptado a Anabaena, para ser introducidos en mutantes de Anabaena que portaban las deleciones sepJ (estirpe CSVM34) o fraC-fraD (estirpe CSVT22), respectivamente. La complementación de CSVM34 con sepJ de RintHH01 y de CalSC01 se hizo de forma que la expresión de estos tenía lugar desde el promotor natural del sepJ de Anabaena. Sin embargo, ni la complementación con sepJ de RintHH01 ni la realizada con sepJ de CalSC01 consiguieron revertir el fenotipo mutante, ni siquiera parcialmente. En cambio, sí se consiguió revertir al fenotipo silvestre cuando el mutante se complementó con sepJ de la propia Anabaena utilizado como control positivo. Por otro lado, los genes fraC-fraD de RintHH01 se transfirieron a la estirpe CSVT22 con dos estrategias distintas: en una su expresión tenía lugar desde el promotor natural fraC de Anabaena, y en otra la expresión tenía lugar desde el promotor glnA (promotor de fuerte expresión en condiciones de deficiencia de nitrógeno) insertado en un plásmido replicativo de Anabaena. Por su parte, la complementación de CSVT22 con los genes fraC-fraD-fraE de CalSC01 solamente se intentó con expresión desde el promotor glnA en un plásmido replicativo. Nuevamente ninguna de las complementaciones abordadas tuvo éxito. Es más, las expresiones génicas realizadas bajo el promotor glnA causaban efectos perjudiciales para Anabaena, como pudimos comprobar con controles utilizando los propios genes de Anabaena, lo que sugiere que quizás no habíamos expresado los distintos genes en sus niveles óptimos de funcionalidad. La última parte de esta Tesis se dedicó a la realización de un breve estudio de la proteína FraE, siendo esta la otra proteína codificada en el operon fraC-fraD-fraE de Anabaena. FraE es una proteína de membrana necesaria para la integridad del filamento. En este capítulo se estudió su localización, para lo que se construyó una estirpe de Anabaena que producía FraE-sfGFP. Los ensayos de análisis de fluorescencia de la GFP llevados a cabo con esta estirpe pusieron de manifiesto que FraE se localiza principalmente en los polos de los heterocistos y que sus niveles disminuyen a las 48 horas de inducción en un medio sin nitrógeno combinado.
Implicación de las caspasas-3 y -8 en el trastorno del espectro autista y la enfermedad de Parkinson
(2020-03-06) García Domínguez, Irene; Venero Recio, José Luis; Martínez de Pablos, Rocío; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
El trastorno del espectro autista (TEA) y la enfermedad de Parkinson (EP) son dos desórdenes neurológicos que presentan elevada prevalencia con un coste socioeconómico importante y una fuerte carga para los pacientes y sus familiares, por lo que sus causas son un importante objeto de estudio. Estos dos desórdenes tienen en común la implicación del sistema dopaminérgico (DAérgico). Se ha demostrado que las caspasas asesinas, entre ellas caspasa-3 y caspasa-8, tienen otras muchas funciones aparte de su conocida participación en fenómenos de apoptosis. Así, por ejemplo, nuestro grupo es el primero en demostrar que a nivel neuronal las caspasas asesinas juegan un importante papel en el neurodesarrollo y en la homeostasis neuronal del sistema DAérgico. Con estos antecedentes, en el presente trabajo se han estudiado dos modelos animales delecionados en caspasa-3 o caspasa-8 en el linaje catecolaminérgico; Caspasa 3f/d TH-IRESCre (Caspasa 3 floxeado/delecionado Tyrosine hydroxylase-internal ribosomal entry sequence) y Caspasa 8f/d TH-IRES-Cre, para así dilucidar el papel de estas caspasas en la funcionalidad y desarrollo del sistema DAérgico, así como su posible implicación en el TEA y la EP. Nuestro estudio muestra importantes alteraciones en las vías DAérgicas para ambos modelos animales, principalmente en la vía nigro-estriada, aunque se presumen posibles cambios en las vías mesolímbica y mesocortical. Además, los animales carentes de caspasa3 y caspasa-8 presentan rasgos fenotípicos muy acordes con el TEA, principalmente a nivel conductual, así como aspectos bioquímicos de este desorden que, de hecho, podrían justificar sus síntomas principales. Por ello, concluimos que la carencia de caspasa-3 o caspasa-8 en el linaje catecolaminérgico podría dar lugar a un modelo animal que mimetice algunas características biomoleculares y conductuales de esta enfermedad, completando los estudios existentes hasta ahora en cuanto a modelos animales para el TEA. Por otro lado, la muerte de las neuronas DAérgicas es la principal característica neuropatológica de la EP y la principal causante de sus síntomas. Además, existen evidencias de apoptosis extrínseca e intrínseca y de la implicación de las caspasas-3 y -8 durante la enfermedad. Para nuestro estudio se utilizó un modelo animal sub-agudo de EP por tratamiento con la neurotoxina 1-metil-4-fenil,6-tetrahidropiridina (MPTP), que induce la muerte apoptótica DAérgica. Teniendo en cuenta la participación de las caspasas asesinas en la apoptosis de las neuronas DAérgicas que acontece a la EP y en la regulación de fenómenos de muerte celular, se postuló que la ausencia de las caspasas-3 y -8 en el linaje catecolaminérgico, podría proteger frente a la muerte neuronal DAérgica tras el tratamiento. Nuestro estudio muestra cómo la ausencia de caspasa-3 o caspasa-8 no protege frente a la depleción DAérgica tras el tratamiento, ya que los fenómenos de muerte celular continúan desarrollándose. De hecho, la ausencia de caspasa-3 parece ser especialmente perjudicial, ya que la muerte neuronal en estas condiciones se desvía a necrosis, con fenómenos inflamatorios asociados importantes, junto a una mayor degeneración neuronal DAérgica. La ausencia de caspasa-8 sin embargo, no produce cambios en la degeneración, ya que se desarrollan fenómenos de apoptosis intrínseca, normales en el modelo, evitando la respuesta inflamatoria.
Proceso bifásico (físico-fermentativo) para la conversión de lodos de depuradora en bioestimulantes: evaluación funcional y diseño de planta piloto
(2020-06-04) Caballero Jiménez, Pablo; Parrado Rubio, Juan; Tejada Moral, Manuel; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular; Universidad de Sevilla. Departamento de Cristalografía, Mineralogía y Química Agrícola
La producción de lodos de depuradora, como principal residuo del tratamiento de aguas residuales, presenta una tendencia creciente y supone un problema de ámbito global, especialmente para las estaciones depuradoras de aguas residuales (EDAR) de pequeño y mediano tamaño que no cuentan en sus instalaciones con medios para su gestión. Considerado también como un subproducto, el lodo de depuradora puede suponer una fuente de recursos de interés para la producción de bioestimulantes, cuyo campo se encuentra en auge y en continua búsqueda de nuevas materias primas para el desarrollo de los mismos. Como alternativa al compostaje, que actualmente es la principal vía para la gestión de lodos, este trabajo de tesis doctoral propone un modelo replicable en EDARs de pequeño y mediano tamaño, por el que los lodos son transformados en un complejo bioestimulante con mayor valor añadido que el compost. Este modelo se basa en un proceso que integra dos etapas: un pretratamiento físico seguido de una fermentación aeróbica controlada. La primera fase consiste en un tratamiento a alta presión y temperatura mediante la inyección de vapor de forma directa, seguido de una descompresión súbita que consigue sanitizar el producto, aumentar el contenido soluble y aumenta la biodisponibilidad de la materia orgánica, haciéndolo más susceptible a ser fermentado. La etapa fermentativa, en condiciones controladas, es llevada a cabo por Bacillus licheniformis que, por acción del secretado enzimático, aumenta aún más el contenido soluble y la biodisponibilidad del producto, otorgándole propiedades bioestimulantes. El complejo bioestimulante obtenido está formado por esta rizobacteria promotora del crecimiento en plantas (PGPR), su secretado, rico en enzimas degradativas, un componente soluble, constituido principalmente por un hidrolizado proteico y otras biomoléculas altamente biodisponibles, y un componente orgánico insoluble accesible a la degradación microbiana como resultado del pretratamiento físico y de la acción microbiana. En esta tesis doctoral se muestran los estudios realizados para diseñar el proceso englobado en la unidad de fermentación, así como su implementación a escala demostrativa. Así mismo, se han realizado estudios funcionales para evaluar los productos obtenidos. Son destacables la capacidad de B. licheniformis para degradar compuestos xenobiótiocos tóxicos presentes con alta frecuencia en los lodos de depuradora, así como la capacidad del complejo bioestimulante, principalmente de la fracción soluble, de estimular la microbiota del suelo. Además, se ha evaluado de forma individual el efecto en suelo de la enzima proteasa, una de las que componen el secretado de B. licheniformis, que ha mostrado capacidad bioestimulante en sí misma, además de provocar cambios interesantes, desde el punto de vista agronómico, sobre la biodiversidad bacteriana del suelo. El proceso desarrollado ha demostrado ser una alternativa interesante y técnicamente factible a tener en cuenta para la gestión de lodos de depuradora, promoviendo la valorización de este subproducto mediante su conversión en bioestimulantes en el marco de la economía circular.
Optimización de la producción de esporas y extractos proteicos de cepas industriales de Trichoderma para su aplicación en control biológico
(2005-09-26) Gómez Álvarez, Martha Isabel; Bautista Palomas, Juan Dionisio; Monte Vázquez, Enrique; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
Estudio de las glicoproteinas del sistema mayor de histocompatibilidad en una línea tumoral humana (MSM). Regulación por agentes biológicos y farmacológicos
(1986-09-02) Morales Suárez-Varela, María Teresa; Machado de la Quintana, Alberto; Peña Martínez, José; Alonso Díaz, Corona; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
Estudio histopatológico del hipocampo de un modelo animal transgénico PS1XAPP de la enfermedad de Alzheimer
(2007-03-14) Sánchez Varo, Raquel María; Gutiérrez Pérez, Antonia; Vitorica Ferrández, Francisco Javier; Universidad de Sevilla. Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal

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