Análisis de la asociación entre enfermedad de Behçet y polimorfismo de los transportadores TAP1 y TAP2: codificados por la región de clase II del complejo mayor de histocompatibilidad

Abstract

La enfermedad de Behçet (EB), descrita originalmente en 1937 a partir de la triada sintomática de aftas orales, aftas genitales y uveítis anterior, es un proceso de naturaleza autoinmune caracterizado por una sintomatología mucho más proteiforme de lo que se sospechó inicialmente, tras sus primeras definiciones.

La enfermedad es muy frecuente a lo largo de una franja territorial comprendida entre las latitudes 30º y 45º del hemisferio Norte. Nuestros propios estudios en Andalucía, establecen una frecuencia del 9 por 100.000, que confirma una vez más esta distribución territorial. La elevada prevalencia de EB, obliga a considerarla, no como una rareza, sino como un proceso de gran interés, por sus graves consecuencias, desde el punto de vista sanitario.

La causa de la EB continúa siendo desconocida a pesar de que han transcurrido más de 50 años desde su descripción. No obstante, la acumulación territorial antes citada, ha dado lugar a numerosas investigaciones acerca de su etiopatogenia que apuntan en dos direcciones. En primer lugar, se ha especulado acerca de la importancia que pueden tener los factores ambientales. Halusi Behçet, en su trabajo inicial ya expresó la opinión de que podría existir un hipotético factor vírico desencadenante y, con posterioridad, distintos trabajos han sugerido una posible relación entre el virus herpes tipo I (VHS-1) y el desarrollo de la EB.

Otra consecuencia a que da lugar la acumulación geográfica de los pacientes, es la consideración de la importancia que pueden tener los factores genéticos y, concretamente, el papel crucial de los antígenos HLA, codificados por genes del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH). Una amplia revisión acerca de este tema ha sido desarrollado en una Tesis Doctoral realizada en nuestro grupo de trabajo.

Estudios muy recientes han puesto de manifiesto que la exposición de los péptidos antigénicos endógenos (unidos a moléculas HLA-1), por parte de las células presentadoras, está precedida por una fase de procesamiento de los mismos. Dicho procesamiento comprende, en primer lugar, su fragmentación por un sistema enzimático especial, denominado LMP (low molecular mass proteins) descubierto por Mónaco y McDevitt, en 1982. El complejo LMP está codificado por dos genes polimórficos (denominados LMP2 y LMP7) que se localizan en la región de clase II del CMH (entre las subregiones DP y DQ). El complejo LMP tiene la particularidad de escindir los péptidos en unidades menores que contienen, casi invariablemente, nueve aminoácidos.

La unión de los fragmentos peptídicos, originados por los complejos LMP, con las moléculas HLA de clase I se produce dentro del sistema retículo endoplasmático (RE). Pero los fragmentos no penetran en su interior por simple difusión; precisan de un sistema transportador constituido por proteínas heterodímericas codificadas por dos genes. TAP1 y TAP2 (transporter associated with antigen processing), también de carácter polimórfico, ancladas en las membranas del RE.

La variabilidad que caracteriza a los genes LMP y TAP ha conducido a la suposición de que se comportan como elementos de producción y selección de fragmentos peptídicos de carácter específico. Es decir, el polimorfismo de LMP daría lugar a la producción de distintos transportadores y seleccionaría la penetración en el RE de subconjuntos de péptidos también diferentes. Esta variación funcional, consecuencia del polimorfismo molecular que, aunque no ha sido aún suficientemente probada en humanos, parece demostrada en roedores y es de importancia capital: la presentación de epitopos absolutamente distintos de un mismo antígeno en diferentes individuos podría explicar las diferencias individuales en la respuesta inmune y en la predisposición a padecer enfermedades asociadas al CMH.

Son muy escasos, discordantes, y todos ellos muy recientes, los trabajos que analizan posibles asociaciones entre algunas enfermedades de naturaleza autoinmune y el polimorfismo de los genes TAP o LMP. Para la EB, donde se ha demostrado ampliamente la asociación de determinados alelos HLA de clase I y II tanto con la enfermedad en sí como con determinadas variantes clínicas de la misma, no existe ningún estudio, hasta la fecha, que analice el posible papel inductor que pueden jugar los genes TAP1 y TAP2.

Aunque se han encontrado relaciones entre EB y determinados antígenos HLA de clase II, la asociación más fuerte se produce, en esta enfermedad, con antígenos de clase I (asociación positiva con B51 y negativa con B15). Estos antígenos están ligados funcionalmente de forma mucho más directa con los genes TAP. Consideramos de un gran interés continuar la línea de investigación seguida en nuestra Unidad ampliándola al estudio de estas últimas moléculas en un esfuerzo por lograr establecer sistemas de marcadores más efectivos en un proceso como el que nos ocupa, donde los problemas de diagnóstico y prevención entrañan grandes dificultades.

En este trabajo nos planteamos los siguientes objetivos:

1) Estudiar las frecuencias relativas de los alelos de los genes TAP1 y TAP2 en nuestra serie de pacientes con EB, previamente tipados para antígenos de clase I y II por métodos serológicos y mediante secuencia específica de oligonucleótidos.

2) Comparar dichos resultados con los observados en una población control sana.

3) Estudiar si existe una mayor susceptibilidad a padecer la enfermedad (y/o algunas de sus variantes sindrómicas) en individuos portadores de alguna de las formas alélicas en concreto.

4) Comparar la intensidad de dichas hipotéticas asociaciones en relación con la que confieren los genes de clase I y II utilizando para ello los resultados obtenidos en nuestra propia serie.

5) Analizar, en su caso, el carácter independiente o no con respecto a otros genes (desequilibrios de ligamentos con moléculas HLA) de las posibles asociaciones.

6) Valorar la utilidad de las moléculas TAP como factores discriminantes de subgrupos sintomáticos dentro de un análisis multivariante.

La población objeto de estudio comprende 57 pacientes con EB. El tipaje de moléculas HLA de clase I se realizó usando linfocitos de sangre periférica, mediante tests de microlinfocitotoxicidad de acuerdo con la técnica estándar NIH. Para moléculas HLA de clase II se empleó la técnica de “oligotyping” tras amplificación por PCR. En cuanto a genes TAP, los alelos relativos a los loci TAP1 y TAP2 se recocieron de acuerdo con la presencia de determinadas combinaciones polimórficas identificadas usando la técnica de PCR-ARMS descrita por Powis et al.

En cuanto al tratamiento estadístico: a) Las asociaciones simples se estudiaron mediante la prueba de ji al cuadrado. B) El riego relativo para forma alélica se estudió mediante la fórmula de Wolf.

Se comprobó, en nuestra muestra, que las moléculas TAP ejercen efectos modificadores complejos sobre el resto de los factores etiopatogénicos que actúan en la EB y que condicionan, al menos en parte, el espectro de manifestaciones clínicas en los sujetos afectos. Mientras que TAP1C paree actuar como factor protector con respecto a la enfermedad de Behçet, TAP1B se comporta como factor de riesgo de participación neurológica. Los pacientes con desarrollo más temprano de uveítis fueron, con mayor frecuencia, negativos pata TAP1B, positivos para TAP2B y negativos para TAP2C. TAP2B se comportó como factor de riesgo para manifestaciones gastrointestinales.

No se demostró ninguna sociación entre alelos TAP1 o TAP2 con HLAB51 ni en la serie total ni en ninguna de las variedades clínicas (incluida especialmente la serie ocular). TAP1B y TAP2B se asociaron positivamente a la presencia de DQ5 en pacientes pero no en controles y TAP1B y TAP2B lo hicieron con DQB1*0501; todas estas relaciones en pacientes no se comprobaron en controles. TAP2B se comportó como un agente inductor de participación ocular, no sólo influyendo en su mayor precocidad sino también anulando el papel protector que se ha supuestos que confiere DQB1*0501.

En el modelo multivariante, la muestra pudo ser descrita por medio de tres dimensiones o ejes factoriales, que explicaban el 100% de la varianza de los datos. Los genes TAP, especialmente sus formas alélicas TAP1B, TAP2B y TAP2C, se comportaron, junto a otras variables clínicas y biológicas (DQB1*0501) como elementos con significación estadística que ayudaron a delimitar los diversos grupos de pacientes. Las relaciones de estos alelos, en dicho sistema, con el resto de los parámetros clínicos y biológicos fueron muy concordantes con las que se observaron mediante los modelos lineales.