Identificación de componentes moleculares sinápticos que contribuyen a la vulnerabilidad de los terminales nerviosos motores en un modelo múrido de atrofia muscular espinal

Abstract

La Atrofia Muscular Espinal (AME), la causa genética más frecuente de mortalidad infantil, es una enfermedad neurodegenerativa autosómica recesiva caracterizada por la pérdida de las motoneuronas α de la médula espinal, debilidad muscular y parálisis progresiva de los músculos axiales y proximales. La AME está causada por la pérdida o mutación en homocigosis del gen de Supervivencia de Motoneuronas 1 (SMN1), que codifica para la proteína de Supervivencia de Motoneuronas (SMN). Esta proteína se expresa ubicuamente y es importante en el ensamblaje de las ribonucleoproteínas pequeñas nucleares (snRNP). En modelos de ratón de AME, la liberación de neurotransmisor está gravemente alterada. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la disfunción sináptica y las bases de la vulnerabilidad muscular selectiva se desconocen. Los objetivos del presente estudio fueron obtener una visión más profunda del origen del déficit de la liberación de neurotransmisor en los terminales nerviosos motores, e investigar las bases moleculares de la vulnerabilidad muscular selectiva en AME. Con este fin, se compararon las propiedades moleculares y funcionales de los terminales nerviosos en músculos con diferente grado de vulnerabilidad en el modelo de ratón SMNΔ7 usando técnicas electrofisiológicas, inmunomarcaje, microscopia de fluorescencia confocal y análisis cuantitativo de imágenes. Los resultados muestran que los niveles de expresión de sinaptotagmina-2 (Syt2), y su proteína de interacción, la proteína de la vesícula sináptica 2 (SV2) B, estaban muy reducidos en los terminales AME en comparación con los controles, mientras que otras proteínas sinápticas, como sintaxina-1B ( Stx1B) y sinaptotagmina-7 (Syt7), no se vieron afectados. También se encontró que sinaptotagmina-1 (Syt1) se somete a un proceso de regulación fisiológica a la baja durante el desarrollo postnatal en los terminales nerviosos de los músculos más vulnerables, pero no en los menos afectados, lo que podría ser particularmente crítico cuando Syt2 está también patológicamente disminuida. Además, los ratones SMN7 muestran una reducción en la densidad de los canales de Ca2+ dependientes de voltaje tipo P/Q en la unión neuromuscular. En consonancia con la reducción de los canales de Ca2+ y el bajo contenido de Syt2, Syt1 y SV2B en las sinapsis neuromusculares más afectadas, el análisis funcional de la neurotransmisión reveló una gran reducción en la liberación evocada, una alteración de la plasticidad a corto plazo, una baja probabilidad de liberación y la incapacidad para modular normalmente el número de sitios de liberación activos. Por último, a pesar de las alteraciones estructurales y funcionales que caracterizan a los terminales nerviosos motores en AME, todavía conservan la capacidad de regular positivamente, en cierta medida, la neurotransmisión en presencia de moduladores de la liberación sináptica. Conjuntamente, proponemos que la gran reducción de Syt2 y SV2B es un factor clave en el déficit funcional sináptico y que la regulación fisiológica de Syt1 juega un papel determinante en la vulnerabilidad muscular selectiva en AME.

Spinal Muscular Atrophy (SMA), the most frequent genetic cause of infant mortality, is an autosomal recessive neurodegenerative motor neuron disease characterized by the loss of spinal cord α-motoneurons, muscle weakness and progressive paralysis of axial and proximal limb muscles. SMA is caused by the homozygous loss or mutation of the Survival Motorneuron 1 (SMN1) gene, which codes for the Survival Motor Neuron (SMN) protein. This protein is ubiquitously expressed, and it is important in the assembly of small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs). In SMA mouse models, neurotransmitter release is greatly impaired. However, the molecular mechanisms of the synaptic dysfunction and the basis of the selective muscle vulnerability are unknown. The aims of the present study were to get a deeper insight into the origin of the neurotransmitter release deficit at motor nerve terminals, and investigate the molecular basis of selective muscle vulnerability in SMA. To this end, we compared the molecular and functional properties of nerve terminals in muscles with different degree of vulnerability in the SMNΔ7 mouse model using electrophysiological techniques, immunostaining, confocal fluorescent microscopy, and quantitative imaging analysis. The results show that the expression levels of synaptotagmin-2 (Syt2), and its interacting protein, synaptic vesicle protein 2 (SV2) B, were highly reduced in SMA terminals in comparison with controls, while other synaptic proteins, as syntaxin-1B (Stx1B) and synaptotagmin-7 (Syt7) were unaffected. We also found that synaptotagmin-1 (Syt1) undergoes a process of physiological downregulation during the postnatal development in nerve terminals of the most vulnerable muscles, but not in the least affected, what could be particularly critical when Syt2 is also pathologically decreased. Additionally, SMN7 mice show a reduction in the density of P/Q-type voltage dependent Ca2+ channels in the neuromuscular junction. Consistently with the reduction of Ca2+ channels and the low content of Syt2, Syt1, and SV2B in most affected neuromuscular synapses, functional analysis of neurotransmission revealed a great reduction in evoked release, impaired short term plasticity, low release probability and inability to modulate normally the number of active release sites. Finally, despite the structural and functional alterations which characterize the motor nerve terminals in SMA, they still retain the ability to upregulate, to certain extend, neurotransmission in the presence of modulators of synaptic release. Together, we propose that the large reduction of Syt2 and SV2B are crucial factors of the functional synaptic deficit and that the physiological downregulation of Syt1 plays a determinant role in selective muscle vulnerability in SMA.