Estudio del daño en el ADN inducido por compuestos polifenólicos de la dieta

Abstract

El cáncer es una enfermedad causada por la acumulación de daño en el ADN . Las células cancerosas presentan numerosas alteraciones genéticas, epigenéticas y cromosómicas, que juegan un papel fundamental en el desarrollo de la enfermedad . Estas alteraciones pueden producirse como consecuencia del propio funcionamiento celular. Por ejemplo, se sabe que las especies reactivas de oxígeno generadas durante la respiración celular y los errores cometidos por las enzimas ADN polimerasas durante la replicación del ADN son fuentes importantes de daño genético . El ADN también puede dañarse como consecuencia de la exposición celular a factores externos, entre los que destacan la radiación, ciertos agentes infecciosos y numerosos compuestos químicos. Algunos de estos compuestos químicos se encuentran en la dieta. Los polifenoles están ampliamente distribuidos en alimentos de origen vegetal. Numerosos estudios indican que los polifenoles de la dieta tienen un efecto beneficioso para la salud, posiblemente debido a su conocida actividad antioxidante. Algunos polifenoles están estudiándose en ensayos clínicos para la prevención y el tratamiento de algunas enfermedades. También suelen consumirse en forma de suplementos dietéticos, generalmente a dosis más elevadas de las que se consiguen en una dieta equilibrada. El hecho de que ciertos polifenoles se encuentren en numerosos alimentos puede sugerir que estos compuestos carecen de toxicidad. Sin embargo, existen estudios en decenas de miles de personas que indican que ciertos antioxidantes comunes en la dieta (beta-caroteno y vitamina E) aumentan de forma significativa el riesgo de tener cáncer cuando se administran en forma de suplementos. Resultados previos de nuestro equipo de investigación indican que varios polifenoles comunes en la dieta inducen niveles elevados de complejos de rotura ADN-topoisomerasa en células humanas . Debido a que la formación de estos complejos de rotura está asociada a procesos genotóxicos y carcinogénicos, es importante estudiar en profundidad la capacidad de estos polifenoles de inducir daño en el ADN. El objetivo fundamental de esta tesis ha sido el estudio del daño en el ADN inducido por polifenoles frecuentes en la dieta, centrándonos en aquellos que inducían daño mediado por las enzimas topoisomerasas. En primer lugar realizamos una revisión bibliográfica sobre los estudios experimentales en los que se había evaluado la genotoxicidad a nivel celular de polifenoles comunes en la dieta. Recopilamos estos estudios para varios polifenoles: los flavonoides genisteína, (-)-epigalocatequina-3-galato (EGCG), quercetina, luteolina, kaempferol, fisetina y miricetina; y los polifenoles no flavonoides curcumina, acido clorogénico, resveratrol, ácido gálico y ácido elágico. Parte de esta información la hemos incluido en varias publicaciones científicas. Posteriormente evaluamos la capacidad de EGCG y ácido clorogénico de inducir complejos de rotura ADN-topoisomerasa en células humanas. Estos dos polifenoles son especialmente comunes en la dieta debido a que son los componentes mayoritarios del té verde y del café, dos bebidas ampliamente consumidas a nivel mundial. Mediante la técnica de inmunofluorescencia TARDIS, observamos que ambos compuestos inducían niveles celulares elevados de complejos de rotura de ADN tanto con la enzima topoisomerasa I como con la II. Confirmamos mediante las técnicas del cometa y de detección de focos ¿-H2AX que el ácido clorogénico inducía daño en el ADN en distintos tipos celulares. Estos resultados son la base de dos trabajos ya publicados. Las células poseen mecanismos de reparación del daño en el ADN. Sin embargo, hay personas que nacen con defectos en genes necesarios para que estos mecanismos de reparación funcionen correctamente. Estas personas son más susceptibles a agentes genotóxicos y más propensas a desarrollar cáncer. Por ejemplo, las mutaciones en el gen BRCA2 aumentan el riesgo de padecer varios tipos de cáncer, como el de mama y ovario . Esto es debido a que la proteína codificada por este gen es fundamental para el funcionamiento adecuado de una vía de reparación denominada recombinación homóloga (HR), que se encarga de reparar roturas de ADN de doble cadena. Personas que nacen sin mutaciones en genes implicados en la reparación del daño en el ADN pueden desarrollarlas durante un proceso carcinogénico. De hecho, la mayoría de los tumores analizados presentan alguna mutación en estos genes. Esto significa que las personas que nazcan con mutaciones en genes reparadores del ADN, o que desarrollen estas mutaciones durante un posible proceso carcinogénico, serán hipersensibles a la toxicidad causada por compuestos que induzcan tipos de daño que requieran de esos genes para su reparación. Un objetivo importante de esta Tesis ha sido, por tanto, evaluar si la genotoxicidad de los polifenoles aumentaba en células con defectos en la reparación del daño en el ADN. Tras realizar y publicar un trabajo bibliográfico sobre las principales rutas de reparación del daño en el ADN, utilizamos una colección de células deficientes en las principales rutas de reparación para evaluar si alguno de nuestros polifenoles era más citotóxico en células deficientes que en sus correspondientes células no deficientes. Observamos que genisteína, luteolína, quercetina, miricetina, fisetina, curcumina, ácido cafeico y ácido gálico fueron más citotóxicos en células deficientes en HR. El ácido gálico fue más citotóxico en células deficientes en la vía de reparación por escisión de bases (BER) y resveratrol indujo más citotoxicidad en células deficientes en reparación por escisión de nucleótidos (NER). Decidimos estudiar en mayor profundidad la genotoxicidad de los flavonoides genisteína y luteolína. Genisteína es una isoflavona de la soja cuyo consumo se ha asociado a una disminución del riesgo de cáncer de mama. Sin embargo, varios estudios sugieren que este isoflavonoide podría aumentar del riesgo de este tipo de cáncer. Debido a que la presencia de defectos en el gen BRCA2 aumenta el riesgo de cáncer de mama, evaluamos el efecto de genisteína en células deficientes en BRCA2 mediante ensayos clonogénicos. Observamos que las células deficientes en BRCA2 fueron más sensibles al efecto citotóxico de genisteína. Mediante el ensayo de detección de focos con anticuerpos contra las proteínas gamma-H2AX y 53BP1 también observamos que genisteína inducía más roturas de doble cadena en células deficientes en BRCA2. Luteolina, un flavonoide presente en numerosos alimentos de origen vegetal, también fue más citotóxico en células deficientes en BRCA2. Sin embargo, a diferencia de genisteína, luteolina indujo menos roturas de doble cadena en células deficientes en BRCA2 que en las células que tenían intacto este gen. Estos datos sugieren que personas con defectos genéticos en BRCA2 podrían ser más sensibles a la citotoxicidad de genisteína y luteolina. Sin embargo, la formación de roturas de doble cadena inducidas por luteolina no explica por qué este flavonoide es más tóxico en células deficientes BRCA2. Al analizar el perfil farmacocinético de los polifenoles estudiados, observamos que las concentraciones plasmáticas de estos compuestos tras la administración oral eran generalmente inferiores a las concentraciones que requeríamos para observar daño en el ADN a nivel celular. Consideramos oportuno revisar la bibliografía y evaluar el daño genético de algunos metabolitos de polifenoles para ver si retenían su toxicidad a concentraciones más bajas. El ácido cafeico es un metabolito detectado en plasma tras la administración oral del ácido clorogénico, polifenol mayoritario del café. Observamos que el ácido cafeico inducía daño genético a concentraciones más bajas que el ácido clorogénico. También observamos que células deficientes en la vía de reparación denominada anemia de Fanconi (FA) eran hipersensibles a la citotoxicidad (ensayo clonogenico) y al daño en el ADN (ensayo de focos ¿-H2AX) inducidos por el ácido cafeico y por un extracto liofilizado comercial de café. Personas que nazcan con la enfermedad genética FA, o que desarrollen mutaciones en esta ruta de reparación, podrían ser hipersensibles a la posible genotoxicidad inducida por un consumo excesivo de café. De hecho, existen estudios epidemiológicos que sugieren que el café podría aumentar el riesgo de desarrollar algunos tipos de cáncer. También evaluamos mediante el ensayo del cometa los niveles de daño en el ADN en células expuestas a varios ácidos fenoles, metabolitos importantes de flavonoides. Únicamente observamos un ligero efecto genotóxico en células expuestas a dosis elevadas de los ácidos protocatéquico y p-hidroxibenzoico. Estos metabolitos no parecen por tanto contribuir al posible efecto genotóxico asociado al consumo de algunos flavonoides. No podemos descartar que el metabolismo de algunos polifenoles genere metabolitos genotóxicos desconocidos, o que cause alguna alteración en procesos biológicos asociados a la carcinogénesis. Por último, nos gustaría destacar que el daño en el ADN producido por algunos polifenoles podría explotarse desde el punto de vista terapéutico. Las células cancerosas tienen defectos en reparación del daño en el ADN, que las pueden más sensibles que las células normales al tratamiento con fármacos genotóxicos. En un trabajo de revisión reciente observamos que la citotoxicidad de 60 fármacos usados en pacientes con cáncer era superior en células deficientes en reparación . Durante esta Tesis hemos observado que algunos polifenoles (EGCG, ácido clorogénico) y derivados semisintéticos de estos compuestos (derivados del hidroxitirosol) matan células cancerosas a dosis a las que no afectan a células sanas. En resumen, este trabajo muestra que ciertas dosis de algunos polifenoles de la dieta producen daño en el ADN a nivel celular, y que este daño es generalmente superior en células deficientes en reparación del daño genético. Las concentraciones plasmáticas alcanzadas cuando estos compuestos se administran por vía oral suelen ser bastante inferiores a las necesarias para inducir daño genético. Esto sugiere que el efecto beneficioso asociado a un consumo equilibrado de alimentos que contengan polifenoles es superior al posible efecto carcinogénico asociado a estos compuestos. Sin embargo, en algunos casos estas concentraciones están próximas a las que generan daño genético celular, especialmente cuando las células tienen deficiencias en reparación. Esto sugiere que el consumo continuado de ciertos polifenoles a dosis elevadas (suplementos) puede causar efectos carcinogénicos, especialmente en personas cuyas células tengan defectos en genes implicados en la reparación del daño en el ADN.