Drenaje biliar interno versus anticuerpos anti-factor de necrosis tumoral -alfa sobre las alteraciones de la inmunidad celular en la ictericia obstructiva experimental

Abstract

Objetivos: Evaluar el efecto del drenaje biliar interno y los anticuerpos antiTNF-a en las alteraciones de la inmunidad celular, citoquinas y endotoxemia en la ictericia obstructiva experimental; Evaluar las alteraciones de la inmunidad celular en la IO experimental determinando en sangre periférica la respuesta proliferativa a mitógenos linfocitarios, la capacidad fagocítica y oxidativa de neutrófilos y macrófagos y las proporciones entre las diversas subpoblaciones leucocitarias y su grado de activación; Evaluar el estado de las citoquinas y endotoxemia en animales con ligadura de la vía biliar; Comparar el efecto del drenaje biliar interno y de los anticuerpos antiTNF-a en las alteraciones anteriormente descritas. Metodología experimental: Ratas Wistar macho adultas (200-290 g), en jaulas individuales y con libre acceso a pienso standard y agua, y cuyo manejo se hará conforme a los protocolos de la Guía de cuidados y uso de animales de laboratorio del National Institute of Health ( publicación nº86-23, revisado en 1985 ). Las ratas se repartirán al azar en series de 6 animales, uno por cada grupo de trabajo, repitiendo las series hasta incluir 5 animales en cada grupo. Previamente a la cirugía, la anestesia se realizará mediante inyección intraperitoneal de Ketamina (8 mg / 100 g) y Midazolán (0’4 mg / 100 g). Los procedimientos se llevarán a cabo en condiciones de esterilidad y sobre una mesa termorregulada con fuente de luz propia. Ligadura del conducto biliar (LCB): Los animales se colocarán en decúbito supino más Pillet. La vía de abordaje será por laparotomía media desde xifoides al pubis. Según la técnica standard de IO en ratas modificada 14, realizando una tracción suave del duodeno se expone el conducto biliar común, que es disecado y ligado mediante doble ligadura con seda de 3/0. El cierre de la pared abdominal se hará en dos planos con sutura continua de seda de 3/0. Plan de trabajo: Antes de realizar cualquier procedimiento se recogerá el peso de los animales y se realizará rasurado del abdomen y limpieza del mismo con alcohol yodado. El tiempo medio empleado en la LCB es de 15 minutos y en el drenaje biliar 35. En los grupos control se emplearán tiempos similares, realizando laparotomía media y movilización sin ligadura del conducto biliar común en el de operación simulada. Grupos de trabajo: Tras 14 días de ictericia obstructiva se aplicarán los siguientes tratamientos: Grupo 1: Drenaje biliar; Grupo 2: Administración de anticuerpos antiTNF-a; Grupo 3: Drenaje biliar y anticuerpos antiTNF-a. Estos animales se sacrificarán a los 7 días de aplicar dichos tratamientos. Controles: Grupo 4: L.C.B. y sacrificio a los 14 días; Grupo 5: L.C.B. y sacrificio a los 21 días; Grupo 6: Operación simulada y sacrificio a los 21 días. Recogida de muestras y sacrificio de los animales: Realizando una nueva laparotomía media, se tomará muestra de bilis para su estudio microbiológico, mediante punción del conducto biliar dilatado. La sangre se obtendrá por punción del apex cardiaco vía transdiafragmática. Determinaciones: Subpoblaciones leucocitarias y grado de activación.Se incubará sangre completa con parejas de anticuerpos monoclonales marcados con diferentes fluorocromos con las especificidades: CD3/I-A, CD8/CD4, PanB/I-A, CD11/Mieloides y NK/I-A. Los resultados se leerán por citometría de flujo ( FACScan, Becton Dickinson ); Respuesta a mitógenos.Se aislarán y separarán los linfocitos por gradiente de centrifugación. Se cultivarán los leucocitos durante 48 h con o sin estimulación con Fitohemaglutina . Se añadirá Bromodesoxiuridina y se enfrentarán los linfocitos a DNA-asaI y Ac anti-Bromodesoxiuridina marcado con fluorocromo. La proliferación linfocitaria se estimará midiendo la Bromodesoxiuridina incorporada mediante citómetro de flujo; Capacidad fagocítica.Se incubará sangre completa con Tufsina marcada con fluorocromo. Mediante citómetro de flujo se medirá la fluoresccencia captada por neutrófilos y macrófagos; Capacidad oxidativa. Incubando sangre completa con 1,2,3 Dihidrorodamina y cuantificación por citometría de flujo de la Rodamina; Factor de necrosis tumoral-alfa ( TNF-a ) , endotoxinas y bilirrubina circulantes en plasma se determinarán por enzimoinmunoensayo mediante kits comerciales; Estudio microbiológico de la bilis.