Papel de la vía de señalización de la insulina y mTOR en la infección por el virus de la Hepatitis C. Implicación en el desarrollo de carcinoma hepatocelular

Abstract

Introducción El virus de la hepatitis C (VHC) promueve resistencia a la insulina (RI) y el desarrollo de esteatosis. Al progresar la enfermedad puede provocar la aparición de fibrosis hepática, cirrosis y carcinoma hepatocelular (HCC). Los mecanismos moleculares por los que el VHC induce la RI no están del todo descritos, por tanto es necesario estudiar como la vía de señalización de la insulina es modificada por la infección. Además, la vía de señalización de la insulina activa la vía de supervivencia AKT/mTOR, y los cambios producidos en esta última pueden activar la progresión hacia HCC. La metformina es un fármaco usado en la práctica clínica para mejorar la RI, y su uso ha sido asociado a una aumento en las probabilidad de curación en pacientes con VHC tratados con interferón y ribavirina; además se ha observado como disminuye la probabilidad de aparición de HCC en pacientes cirróticos. Asimismo, la simvastatina (fármaco utilizado contra la dislipemia) también disminuye el riesgo de HCC y por la estrecha relación del VHC con el metabolismo lipídico. Objetivos: 1. Estudiar las modificaciones de la vía de señalización de la insulina en un modelo in vitro de infección por hepatitis C y los efectos producidos por tratamientos con insulina, metformina e interferón α 2a; así como el papel de la metformina sobre la infección viral. 2. Estudio del efecto de la metformina y la simvastatina en la infección por el virus de la Hepatitis C y su asociación con el desarrollo de carcinoma hepatocelular sobre la vía oncogénica de mTOR, en un sistema in vitro de infección con el virus de la Hepatitis C.

Materiales y métodos Se recogieron muestra de sangres de pacientes infectados por VHC genotipo 1, tratados con peginterferon y ribavirina (10 respondedores y 10 no respondedores) previa firma de consentimiento informado. De la sangre se aislaron las células mononuclearesde sangre periférica (PBMC) para extraer el ARN celular y poder medir la expresión génica de la vía de señalización de la insulina por qRT-PCR. Las líneas celulares Huh7.5 y HepG2 se cultivaron en medio DMEM suplementado a 37ºC, 5%CO2. A las 3 horas del sembrado se añadió la metformina, la insulina, el interferón α 2a o la simvastatina, además las células de la línea Huh7.5 se infectaron con el replicón JFH1. Tras 96 horas, se recogieron las células, o bien para su cuantificación por la cámara de Nuebauer o bien para el aislamiento de ARN total o proteínas totales. La expresión génica se cuantificó mediante qRT-PCR y la expresión proteica por Western-Blot. Para la cuantificación del TCDI50 del JFH1 se recogía el medio de cultivo de las células tratadas a las 96 horas del sembrado y se volvía a infectar células previamente sembradas, a las 48 horas se fijaban para realizar una inmunohistoquímica contra la proteína del core. Los hepatocitos humanos se prepararan a partir de biopsias de pacientes sometidos a resecciones quirúrgicas de tumor hepático, después de haber firmado un consentimiento informado. Tras dos tratamientos con colagenasa se aislaron los hepatocitos. Los hepatocitos se sembrarán a confluencia en placas tratadas con colágeno y mantenidas 12h en medio DMEM-Ham-F12:William´s E (1:1) suplementado. Tras las 12 horas se le cambió el medio y se añadieron los tratamientos (simvastatina 2μM o metformina 2mM) y cada 24 horas se volvía cambiar el medio y se volvían a añadir los tratamientos. Tras 72 horas, se recogieron las células para el aislamiento de ARN total o de las proteínas totales. La expresión génica se cuantificó mediante qRT-PCR y la expresión proteica por Western-Blot. Resultados El virus de la hepatitis C altera la vía de señalización de la insulina in vivo e in vitro; tanto por la modificación de la expresión génica de esta vía en células PBMC de pacientes infectados por el genotipo 1 del virus, como por la inhibición de la proteína PTEN (-1,61±0,17 veces) y el aumento de mTOR y TCTP (1,61±0,13, 2,19±0,9 veces respectivamente) en células de la línea Huh7.5 infectadas con el replicón JFH1. El tratamiento con insulina en células infectadas con JFH1 reduce aún más la cantidad de PTEN (-1,9±0,5 veces), disminuyendo además la proteína AKT (-1,47±0,25 veces), provocando un aumento en la replicación del virus (1,96±0,19). Lametformina en células infectadas por JFH1 además de inhibir mTOR (-2,16±0,36), reduce PTEN, AKT, PTP1B y TCTP (-1,4±017, -1,96±0,14, -1,64±0,2 y -1,92±0,19 respectivamente), y aumenta IRS1 (1,4±0,14). Asimismo, la metformina inhibe el ciclo replicativo del virus de la hepatitis C, al disminuir la replicación viral (55%±26), la proteína core (-5,98±0,4 veces), la producción de virus en el medio de cultivo (83,3%±1,0) y la TCDI50 del medio resultante (9,9±3,4 veces). El tratamiento separado con simvastatina y metformina inhibe la proliferación celular in vitro, de manera dosis dependiente en líneas celulares derivadas de hepatocitos (HepG2 y Huh7.5). La simvastatina inhibe a la proteína mTOR (HepG2: -2,5±0,3 , Huh7.5: -2,16±0,36), así como la metformina además de inhibir a dicha proteína inhibe a PTEN (HepG2: -2,56±0,53, Huh7.5: -1,4±0,17) y PTP1B (HepG2: -1,84±0,39, Huh7.5: -1,64±0,2). La combinación de ambos fármacos inhiben tanto los oncogenes mTOR y TCTP (-2,56±0,89, -1,89±0,39), e inducen el supresor de tumores PTEN (2,08±0,61 veces).Esta combinación de fármacos afecta de manera similar a las células infectadas por JFH1: inhibe mTOR y TCTP, y aumenta PTEN. El marcador de autofagia LC3BII (5,0±2,8) aumenta por el tratamiento con metformina en células infectadas por JFH1. LC3BII también se observa aumentada junto a la Caspasa3 en hepatocitos primarios tratados con metformina (LC3BII: 4,05±2,56, Caspasa 3: 5,64±4,2 veces). Al mismo tiempo, existe un efecto sinérgico de la metformina y la simvastatina sobre la inhibición del ciclo replicativo del virus. Conclusiones: 1. El virus de la hepatitis C modula la vía de señalización de la insulina in vivo e in vitro, a través de mTOR, TCTP y PTEN. El uso de la metformina inhibe el ciclo de replicación del virus de la hepatitis C en un sistema in vitro. 2. La metformina y la simvastatina inhiben la proliferación celular y la replicación del VHC en un sistema in vitro, disminuyendo los niveles de TCTP (oncogen) y aumentado PTEN (supresor de tumores). Además, la metformina aumentó la cantidad de LC3B, un marcador de autofagia. La simvastatina y la metformina podrían contribuir a la prevención y a la terapia contra el carcinoma hepatocelular