Globulinas de semilla de uva como moduladores del color de antocianos. Aproximación in silico molecular y colorimétrica a las interacciones proteína-pigmento

Abstract

La estabilización química de los pigmentos del vino, y por tanto del color, constituye una de las líneas de investigación más importantes en el campo de la enología y, en particular, es uno de los principales problemas con los que sigue enfrentándose el sector enológico, especialmente en climas cálidos. Un mecanismo de particular interés para la estabilización de los pigmentos antociánicos son las interacciones que estos establecen con una gran variedad de compuestos orgánicos como las proteínas. El estudio de las interacciones proteína-antociáno y sus bases moleculares es crucial en el desarrollo de estrategias enológicas para compensar las deficiencias de estabilidad de color de vinos tintos, basadas en la aplicación de agentes estabilizadores de naturaleza proteica. En esta Tesis Doctoral, se propone abordar este desafío científico-tecnológico, mediante el aprovechamiento de un subproducto de la propia industria enológica, la semilla de uva, como fuente natural y sostenible de proteínas con potenciales propiedades estabilizadoras de los pigmentos del vino y su color. El principal objetivo ha sido comprender los mecanismos moleculares implicados en las interacciones entre proteínas de semilla de uva (globulinas) y el pigmento antociánico mayoritario del vino, la malvidina-3-O-gluco sido (mv3glc), así como evaluar su impacto en el color, por aplicación de metodologías computacionales, proteo micos, espectroscópicos y colorimétricos. Ha sido posible, por primera vez, modelizar y caracterizar las estructuras tridimensionales (3D) de las globulinas 7S y 11S de semilla de uva, mediante técnicas computacionales de modelado por homología. Los modelos construidos, validados y optimizados, confirmaron que las globulinas 7S y 11S de semilla de uva, de similar peso molecular, difieren en su punto isoeléctrico y son ricas en α hélices y la minas β estabilizadas por puentes disulfuro. A su vez, los estudios de docking han permitido esclarecer los tipos de interacciones (fuerzas hidrofóbicas y puentes de hidrógeno, principalmente), así como las distancias que se establecen en los complejos moleculares formados entre estas globulinas y la mv3glc. En los estudios experimentales, se caracterizó la fracción de globulinas 11S de semilla de uva aplicando distintas condiciones de extracción, así como el estudio de las interacciones moleculares entre estas y los antociános del vino en disoluciones modelo, y su efecto en el color. La extracción con tampón fosfato salino a pH 7, combinado con diálisis a 14 kDa, permitió obtener una fracción de globulinas de mayor riqueza proteica. Por su parte, los estudios de fluorescencia confirmaron que la globulina 11S interacciona con la mv3glc mediante un mecanismo esta tico cuya KS fue de 8.5×104 M, dando como resultado un efecto colorimétrico visualmente apreciable en el pigmento, dependiente de la concentración de proteína. Con un enfoque metodológico, se ha desarrollado una técnica de “Colorimetría Triestímulo in silico”, mediante cálculos mecánico-cuánticos aplicados a las estructuras modelizadas, para la predicción de cambios de color producidos en la mv3glc debido a variaciones estructurales, como puede ser la modificación del ángulo diedro del anillo B, y a la interacción establecida con un péptido de semilla de uva.