Ciclodextrinas y glicomiméticos sensibles a estímulos: aplicaciones al transporte de ácidos nucleicos y a la regulación de glicosidasas

Abstract

En las últimas décadas se ha experimentado un avance notable en el diseño y preparación sistemas capaces de participar en procesos biológicos de una manera predecible y controlada, dotándoles de la habilidad de respuesta frente a estímulos con el objetivo de desarrollar de nuevas estrategias terapéuticas. En esta Tesis doctoral se ha propuesto la preparación de dos familias de sistemas: por un lado, transportadores de ácidos nucleicos basados en ciclodextrinas y, por otro, reguladores de la actividad de enzimas glicosidasas lisosomales basados en glicomiméticos de tipo sp2-iminoazúcar con potencial para uso como chaperonas farmacológicas. La terapia génica es una estrategia terapéutica con gran potencial cuyo éxito requiere el diseño de sistemas de transporte adaptados (vectores) capaces de compactar y proteger el material génico. En los últimos años se han desarrollado vectores no virales moleculares, con estructura perfectamente definida empleando como plataforma estructural ciclooligosacáridos de la familia de las ciclodextrinas. La estructura bifacial de las ciclodextrinas y la diferencia de reactividad entre los hidroxilos situados en una y otra cara (primaria y secundaria), nos ha permitido la incorporación de elementos funcionales con una orientación precisa sobre la estructura macrocíclica nanométrica. Aprovechando esta propiedad, a lo largo de esta Tesis se han desarrollado nuevos sistemas vectoriales de ácidos nucleicos, cuya organización resulta dependiente del pH. Por un lado, se han preparado una familia de ciclodextrinas con una anfifilia frustrada provocada por la disposición de cabezas catiónicas en ambas caras de la ciclodextrinas junto a la incorporación de cadenas grasas en una de estas caras. Además, se han preparado los respectivos controles que solo incorporaron los grupos ionizables. El análisis del proceso de autoensamblaje de estas moléculas y co-ensamblaje con ácidos nucleicos evidencian la importancia de esta disposición en la propiedades supramoleculares de los nanocomplejos así como su eficiencia frente a la transfección. Los experimentos de transfección in vitro confirman la eficacia de estos sistemas, abriendo la puerta a su empleo en el desarrollo futuro de terapias génicas específicas frente a diversas enfermedades. Por otro lado, se ha explorado el potencial interés de vectores funcionalizados con ligandos para su utilización en el transporte dirigido a determinadas células, y en particular, el empleo de unidades sacarídicas que puedan interaccionar con proteínas receptoras de membrana. Dentro de este campo, en esta Tesis se ha llevado a cabo la preparación de sistemas multicomponentes basados en ciclodextrinas, los cuales incorporaron restos glicosídicos, clústeres catiónicos y cadenas grasas, así como sus respectivos controles. Diversos estudios han confirmado la interacción entre los sistemas generados y lectinas, así como su complejación con ácidos nucleicos. Dentro de los diferentes estímulos estudiados, la luz representa una alternativa con gran potencial en los últimos años. En esta Tesis doctoral hemos explorado la incorporación de sistemas sensibles a luz en la cara secundaria de ciclodextrinas y hemos estudiados sus propiedades supramoleculares dependiendo de su configuración. Los resultados revelan una clara dependencia de la configuración del fotosistema en la autoorganización de la CD. Mientras que el isómero E forma dímeros, la irradiación de estos provoca su disrupción. Esta propiedad ha sido explotada para generar potenciales vectores de ácidos nucleicos sensibles a la luz. Estudios preliminares confirman la interacción y compactación con el ácido nucleico y su liberación tras irradiación. La segunda parte del proyecto de tesis se centra en la preparación de glicomiméticos y su evaluación biológica frente a diversas enzimas asociadas a patologías. En las últimas décadas se han llevado a cabo estudios que muestran que muchas enfermedades neurodegenerativas asociadas al envejecimiento o a defectos congénitos, como pueden ser la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer o las enfermedades de depósito lisosomal, tienen su origen en el plegamiento incorrecto de una proteína. Esto conlleva a un incorrecto funcionamiento de la proteína o su degradación, originando una acumulación de metabolitos que deberían ser procesados. En cualquier caso las consecuencias son devastadoras, sin que actualmente existan terapias satisfactorias para su tratamiento. A principios de este siglo se postuló que compuestos capaces de unirse reversiblemente a la proteína afectada en estas enfermedades podrían, en una primera etapa, forzar el plegamiento correcto de la misma, evitando su agregación o eliminación, y, en una segunda fase, disociarse de la misma y rescatar su actividad. Mediante este tratamiento, denominado genéricamente terapia de chaperona farmacológica, sería posible detener e incluso revertir el progreso de la enfermedad. Nuestro objetivo es diseñar nuevas chaperonas farmacológicas cuya afinidad por la proteína diana pueda programarse en el tiempo y en el espacio mediante la acción de la luz: una estrategia fotofarmacológica. La última parte de esta Tesis incluye la síntesis, la caracterización fotoquímica, la evaluación in vitro frente a glicosidasas comerciales y la selección de candidatos para su estudio frente a glicosidasas con origen humano (glucocerobrosidasa y α-galactosidasa). Los ensayos biológicos han demostrado el desarrollado de glicomiméticos fotosensibles cuya diferencia de actividad entre isómeros supera los reportados hasta la fecha.

In recent decades, there has been a significant advancement in the design and preparation of systems capable of participating in biological processes in a predictable and controlled manner, endowing them with the ability to respond to stimuli with the aim of developing new therapeutic strategies. In this doctoral thesis, the preparation of two families of systems has been proposed: on one hand, nucleic acid carriers based on cyclodextrins, and on the other hand, regulators of lysosomal glycosidase enzyme activity based on sp2-imino sugar-type glycomimetics with the potential for use as pharmacological chaperones. Gene therapy is a therapeutic strategy with significant potential, the success of which hinges on the design of tailored delivery systems (vectors) capable of compacting and protecting genetic material. In recent years, non-viral molecular vectors have been developed with a well-defined structure, using cyclodextrins from the cyclodextrin family as a structural platform. The bifacial structure of cyclodextrins and the difference in reactivity between the hydroxyl groups located on the primary and secondary faces have allowed us to incorporate functional elements with precise orientation on the nanometric macrocyclic structure. Leveraging this property, throughout this thesis, new nucleic acid vector systems have been developed, whose organization is pH-dependent. On one hand, a family of cyclodextrins with frustrated amphiphilicity has been prepared, induced by the arrangement of cationic heads on both faces of the cyclodextrins along with the incorporation of lipid chains on one of these faces. Additionally, the respective controls were prepared, which only included the ionizable groups. The analysis of the self-assembly process of these molecules and co-assembly with nucleic acids underscores the importance of this arrangement in the supramolecular properties of the nanocomplexes and their efficiency in transfection. In vitro transfection experiments confirm the efficacy of these systems, paving the way for their future use in the development of specific gene therapies for various diseases. On the other hand, the potential of ligand-functionalized vectors for targeted delivery to specific cells has been explored, particularly the use of saccharide units that can interact with membrane receptor proteins. Within this field, this thesis has involved the preparation of multicomponent systems based on cyclodextrins, which incorporated glycosidic residues, cationic clusters, and lipid chains, along with their respective controls. Various studies have confirmed the interaction between the generated systems and lectins, as well as their complexation with nucleic acids. Among the various stimuli studied, light has represented a promising alternative in recent years. In this doctoral thesis, we have explored the incorporation of light-sensitive systems on the secondary face of cyclodextrins and studied their supramolecular properties depending on their configuration. The results reveal a clear dependence of the photosystem configuration on the self-organization of CD. While the E-isomer forms dimers, their irradiation leads to their disruption. This property has been exploited to generate potential light-sensitive nucleic acid vectors. Preliminary studies confirm the interaction and compaction with nucleic acid and their release upon irradiation. The second part of the thesis project focuses on the preparation of glycomimetics and their biological evaluation against various enzymes associated with pathologies. In recent decades, studies have shown that many neurodegenerative diseases associated with aging or congenital defects, such as Parkinson’s disease, Alzheimer’s disease, or lysosomal storage diseases, originate from the misfolding of a protein. This results in incorrect protein functioning or degradation, leading to an accumulation of metabolites that should be processed. In any case, the consequences are devastating, with no currently satisfactory therapies for their treatment. At the beginning of this century, it was postulated that compounds capable of reversibly binding to the affected protein in these diseases could, in a first stage, promote the correct folding of the protein, preventing its aggregation or elimination, and in a second phase, dissociate from it and restore its activity. Through this treatment, generically termed pharmacological chaperone therapy, it would be possible to halt and even reverse the progression of the disease. Our goal is to design new pharmacological chaperones whose affinity for the target protein can be programmed in time and space through the action of light: a photopharmacological strategy. The last part of this thesis includes the synthesis, photochemical characterization, in vitro evaluation against commercial glycosidases, and the selection of candidates for study against human-derived glycosidases (glucocerebrosidase and α-galactosidase). Biological assays have demonstrated the development of photosensitive glycomimetics with an activity difference between isomers exceeding what has been reported to date.