Contribución de y-tubulina a la nucleación de microtúbulos desde los centros organizadores de microtúbulos de células animales

Abstract

El citoesqueleto de microtúbulos (MTs) es una estructura celular sofisticada que mantiene la homeostasis celular, además de cumplir otras funciones fisiológicas tales como el transporte de proteínas, la división o el establecimiento de la polaridad celular. Por ello, la nucleación o formación de novo de MTs es un proceso finamente regulado que permite establecer la estructura especializada de cada tipo celular, así como responder de manera rápida y apropiada a cualquier cambio al que tenga que responder la célula. Los MTs están compuestos por dímeros de αβ-tubulina en forma de filamentos polarizados, cuyo ensamblaje está facilitado por los complejos con forma de anillo de γ-tubulina (γ-TuRC, γ-tubulin ring complex). La formación de novo o nucleación de MTs tiene lugar en distintas estructuras celulares denominadas centros organizadores de MTs (MTOCs), donde los γ-TuRCs son reclutados y activados por distintas proteínas con capacidad de interaccionar con ellos (denominadas reclutadores del γ-TuRC). En células animales en división el centrosoma (CTR) actúa como el principal MTOC celular. Sin embargo, la mayoría de células diferenciadas poseen redes de MTs organizadas desde otros MTOCs alternativos, siendo el aparato de Golgi (AG) el más representativo. Estudios previos de nuestro laboratorio han revelado cómo en células en interfase, la actividad de los diferentes MTOCs está coordinada para asegurar un correcto funcionamiento de la red de MTs, donde el CTR ocupa el lugar principal de una regulación jerarquizada. Además, han demostrado cómo los tradicionalmente considerados receptores del γ-TuRC tienen un papel relevante en la nucleación mediada por el AG, pero sólo contribuyen de forma modesta a la nucleación de MTs desde el CTR. Por todo ello, el trabajo de esta tesis ha consistido en la caracterización del papel de la γ-tubulina en los procesos de nucleación de MTs desde los diferentes MTOCs celulares. Hemos empleado el sistema de degradación inducible mediante auxina (AID) en la línea celular RPE1 para conseguir una rápida y eficiente degradación de la γ-tubulina 1, la isoforma más abundante en estas células. Para ello aprovechamos la tecnología CRISPR/Cas9 y generamos una línea celular knock-in en el gen de esta proteína, de tal manera que se expresase fusionada a la secuencia mAID-mCherry2. Mediante experimentos de microscopía in vivo, combinados con experimentos de inmunofluorescencia en células fijadas, hemos demostrado que la ausencia de γ-tubulina 1 reduce de manera significativa, pero no por completo, la nucleación de MTs tanto desde el CTR como el AG. Por ello, extendimos los análisis a la otra isoforma de la γ-tubulina. En este trabajo hemos demostrado y caracterizado la expresión de la γ-tubulina 2 en células RPE1, y evaluado su contribución a la nucleación de MTs desde ambos MTOCs. Sorprendentemente, los resultados obtenidos han mostrado que esta isoforma tiene un papel dual en el CTR y el AG. Así, mientras que promueve la nucleación desde el CTR, en el AG actúa como un inhibidor, puesto que su ausencia resulta en un incremento de la nucleación de MTs desde este orgánulo. El análisis exhaustivo de este resultado nos permitió caracterizar el mecanismo que provoca el incremento de nucleación desde el AG cuando se inhibe la expresión de la γ-tubulina 2. Nuestros resultados demuestran que en ausencia de γ-tubulina 2, la isoforma γ-tubulina 1 aumenta su reclutamiento a la membrana del AG a través de un mecanismo dependiente de la proteína AKAP450, considerada esencial para la nucleación de MTs desde el AG. Además, el aumento de la nucleación se suprime cuando eliminamos CDK5RAP2, otra de las proteínas de unión al γ-TuRC, que además es reclutada al AG a través de AKAP450. Por lo tanto, el aumento de la nucleación desde el AG es dependiente de AKAP450 y está mediado por CDK5RAP2. Adicionalmente, hemos realizado un análisis bioquímico de la composición del γ-TuRC en ausencia de cada una de las isoformas de γ-tubulina, en busca de diferencias que pudieran explicar los cambios observados en la tasa de nucleación de MTs. Este análisis indicó que en ausencia de la γ-tubulina 1 la mayoría de la proteína del GCP2, que forma parte del γ-TuRC, se degrada. Sin embargo, en esa condición aún se detecta una cantidad muy baja localizada en el CTR, la cual se pierde en ausencia total de γ-tubulina. También hemos evaluado la repercusión que tiene la ausencia de cada isoforma en el estado de la red de MTs de la célula, que se ve afectada especialmente cuando están ausentes ambas isoformas de γ-tubulina. Por último, hemos estudiado las consecuencias de la ausencia simultánea de ambas isoformas de γ-tubulina sobre la capacidad de nucleación de MTs. Nuestros resultados demuestran que la ausencia total de γ-tubulina inhibe la nucleación tanto desde el centrosoma como desde el AG, confirmando que esta proteína es esencial para la nucleación de MTs en células animales en interfase.