Resumen | Para la transmisión fidedigna de la información genética es indispensable
preservar la integridad del genoma. Las células han desarrollado procesos
complejos altamente regulados que velan por la estabilidad del mismo, ...
Para la transmisión fidedigna de la información genética es indispensable
preservar la integridad del genoma. Las células han desarrollado procesos
complejos altamente regulados que velan por la estabilidad del mismo, evitando
o resolviendo problemas que puedan comprometerla. La causa de dicha
inestabilidad genética no sólo radica en la acción de agentes genotóxicos
externos, sino también en aquellos derivados del propio metabolismo celular,
resultado de fallos en los propios procesos endógenos de la célula como la
transcripción, replicación y recombinación. La manifestación de la inestabilidad
genética se presenta generalmente en forma de mutaciones y reordenaciones
cromosómicas, características asociadas a la predisposición a envejecimiento y
procesos tumorales.
Paradójicamente, uno de los procesos más esenciales para la
supervivencia de la célula, la transcripción, puede constituir a su vez una de las
fuentes más importantes de inestabilidad genética. Esto se debe principalmente
a la aparición de ADN de cadena sencilla durante su desarrollo, que es más
susceptible a daños que la doble cadena. Asimismo, la propia maquinaria de
transcripción puede suponer un obstáculo para otro proceso esencial en la célula
como es la replicación, pudiendo derivar todo ello en un aumento de roturas y
recombinación en el ADN. Durante la transcripción, el ARN naciente puede
hibridar con la hebra molde de ADN, de manera que la hebra no transcrita se
mantiene en forma de cadena sencilla. Estas estructuras generadas se conocen
como bucles R (R loops) y están compuestos por un híbrido de ADN-ARN y la
cadena sencilla de ADN desplazada. Si bien se ha demostrado que los R loops
pueden desempeñar importantes funciones fisiológicas, cuando se forman o
acumulan de manera incontrolada pueden suponer una amenaza para la
integridad del genoma.
El ARNm naciente ha de ser correctamente empaquetado en forma de
ribonucleoproteínas mensajeras (mRNPs) para la elongación de la transcripción, la integridad y el procesamiento del ARNm, previo a su transporte al citoplasma.
Dicho ARNm, como sustrato potencial en la formación de R loops, ha de ser
pertinentemente procesado, empaquetado y protegido para evitar que hibride
con el ADN molde. Es por ello que, durante su procesamiento, existen
numerosos factores que se unen al ARNm y contribuyen a proteger el genoma
de la formación de R loops. En esta tesis nos hemos centrado en factores que
tienen un papel en la biogénesis de las mRNPs y en particular en la helicasa
UAP56/DDX39B perteneciente a la familia de helicasas DEAD/H box. Esta
proteína, además de desempeñar un papel en el acoplamiento del madurosoma
(spliceosome), interviene en la interfaz de la transcripción con la biogénesis y
transporte de mRNPs. En concreto, UAP56 interacciona con el complejo THO,
involucrado en la formación de la mRNP, y promedia el transporte de la mayoría
de los mRNAs a través del reclutamiento del factor ALY/REF. El silenciamiento
de UAP56 genera una alta inestabilidad genética en las células. Esto se atribuye
a defectos en la formación de la mRNP, pero se desconoce si este fenotipo está
mediado por R loops.
En la presente tesis hemos querido profundizar en los mecanismos por
los cuales UAP56 contribuye al mantenimiento de la integridad del genoma.
Hemos corroborado que el silenciamiento de UAP56 causa inestabilidad
genética, determinada por un incremento de roturas en el ADN y descubierto
nuevos fenotipos asociados como defectos en la replicación. Además, hemos
desvelado que tanto la inestabilidad como son los defectos en replicación están
mediados por R loops. En colaboración con el laboratorio del Dr. Patrick Sung
en la Universidad de Yale, hemos descubierto que UAP56 es una helicasa de
ADN-ARN capaz de resolver R loops in vitro. In vivo, la sobreexpresión de
UAP56 suprime los fenotipos de inestabilidad mediados por R loops
característicos de diversos mutantes, confirmando su actividad helicasa. Por
último, hemos determinado en todo el genoma las regiones más propicias a
acumular R loops y a donde se une preferentemente UAP56, así como el
transcriptoma resultante del silenciamiento de UAP56.
Debido al creciente número de estudios que relacionan el silenciamiento
de diferentes helicasas de la familia DEAD/H box con la acumulación de R loops,
hemos comparado a nivel de todo el genoma los sitios de acumulación de R
loops tras el silenciamiento de UAP56 y DDX5 para investigar si ambas proteínas
presentan una actividad redundante.
Finalmente, hemos estudiado la contribución del factor de transcripción
Snail1 a la integridad del genoma. Tradicionalmente, el estudio de esta proteína
se ha enmarcado en el contexto de la transición epitelio-mesenquima (EMT),
gracias a la cual las células epiteliales adquieren las características propias de
las células mesenquimales como la pérdida de los contactos intracelulares e
interacción con la membrana basal. Aunque, este proceso es esencial para el
desarrollo, se ha demostrado que se activa de manera anormal en los procesos
cancerosos. Su activación permite a las células adquirir una mayor capacidad de
invasión y metástasis. Un factor crucial encargado de desencadenar el inicio de
esta transición es Snail1. En este trabajo hemos demostrado que el
silenciamiento de Snail1 causa inestabilidad genética y defectos en la replicación
mediados por R loops. Estos datos son particularmente relevantes al sugerir que
pueda existir una posible conexión entre los R loops y la inestabilidad asociada
a cáncer, dado el papel de Snail en determinados procesos cancerígenos.
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