Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS)

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Papel de HIF1 y PHD3 en la microglía de la enfermedad de Alzheimer
(2020-07-10) Lara Ureña, Nieves; Pascual Bravo, Alberto; Universidad de Sevilla. Departamento de Fisiología Médica y Biofísica
Implicación del sistema GSTT1 en la patogénesis de la hepatitis inmune de novo
(2020-07-01) Pozo Borrego, Antonio Jesús; Núñez Roldán, Antonio; Aguilera García, Isabel; Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología
Con el fin de dilucidar los mecanismos fisiopatológicos implicados en el desarrollo de la hepatitis inmune de novo planteamos una serie de objetivos, los cuales se recogen en el siguiente resumen: 1. Explorar la distribución celular de la proteína GSTT1 y estudiar la implicación de los anticuerpos GSTT1 específicos en el fracaso del órgano trasplantado. Con el fin de conocer si los anticuerpos GSTT1 específicos juegan un papel importante en el fracaso del injerto, decidimos estudiar si la proteína en cuestión podía expresarse en la superficie celular para su posterior reconocimiento por los anticuerpos citados anteriormente. Para ello realizamos dos abordajes experimentales distintos (inmunocitoquímica y citometría de flujo) usando la línea celular hepaRG, la cual podía conseguimos diferenciar en hepatocitos y colangiocitos. Como resultado de los experimentos realizados, podemos determinar que la proteína GSTT1 puede localizarse en la membrana celular, a pesar de ser una proteína citoplasmática. De tal forma que la escena patológica ocurriría en un ambiente de alto estrés oxidativo, provocando que la proteína GSTT1 se exprese en la membrana celular, y por tanto los anticuerpos GSTT1 específicos podrían reconocer la diana antigénica y poner en marcha los mecanismos fisiopatológicos responsables de la pérdida del órgano trasplantado. Teniendo en cuenta lo descrito anteriormente, decidimos estudiar muestras de suero de pacientes con y sin enfermedad para determinar las subclases de los anticuerpos anti-GSTT1, con el objetivo de determinar si existe algún patrón característico que nos permita diferenciar ambos grupos de estudio. Estos experimentos fueron llevados a cabo mediante la técnica de ELISA. Tras analizar los resultados obtenidos podemos destacar que la combinación IgG1+IgG4 es la característica mayoritaria en ambos grupos de pacientes. Además, pacientes que han desarrollado la enfermedad presentaban una proporción IgG1/IgG4 superior a 1 en el momento del diagnóstico, cosa que no ocurría en los pacientes sin esta patología. 2. Determinar la presencia de linfocitos T alo-específicos frente a la proteína GSTT1. Por otro lado, decidimos estudiar la respuesta celular T y su posible implicación en el desarrollo de la HI de novo. Inicialmente, realizamos un estudio experimental con el objetivo de determinar la presencia de linfocitos T alo-específicos frente a la diana antigénica. Para ello se utilizaron células mononucleares de sangre periférica de pacientes de los distintos grupos de estudio, la tecnología de los pentámeros/tetrámeros y la técnica de citometría de flujo. Estos pentámeros/tetrámeros son combinaciones sintéticas de moléculas MHC con una secuencia peptídica. Mediante un programa de predicción seleccionamos las mejores combinaciones MHC-péptido. Los pentámeros llevan asociada una molécula MHC de clase I (se ensayaron 3 combinaciones distintas), mientras que los tetrámeros una molécula MHC de clase II (se ensayaron 4 combinaciones distintas). Tras analizar los resultados obtenidos, podemos determinar que tanto el grupo 1 (pacientes con la patología) como el grupo 3 (pacientes que únicamente tienen la condición de riesgo) presentan reactividad en clase I con el pentámero A*01. Esto concuerda con nuestra hipótesis, ya que los pacientes del grupo 3, al carecer de anticuerpos GSTT1-específicos, no disponen de linfocitos B alo-específicos que actúen como células presentadoras de antígeno, a pesar de presentar linfocitos T aloespecíficos. Por tanto, hemos conseguido demostrar la presencia de linfocitos T alo-específicos frente a una secuencia concreta de la proteína diana en combinación con una molécula MHC característica en células de pacientes. 3. Dilucidar el papel que desempeñan los linfocitos T alo-específicos de GSTT1 en el rechazo del injerto. Una vez hallada la presencia de linfocitos T alo-específicos frente a GSTT1, nos planteamos esclarecer los posibles mecanismos implicados en el desarrollo de la patología. En este caso se usaron células mononucleares de sangre periférica aisladas de pacientes de los distintos grupos de estudio y la técnica de citometría de flujo. La activación de dichas células se realizó con péptidos de GSTT1. La diana antigénica se añadía al medio de cultivo y se dejaba un tiempo de incubación de 24 horas. Todos los pacientes con HI de novo presentan activación en alguna población de linfocitos T, si bien llama la atención que no son las poblaciones convencionales CD4+ o CD8+ sino sobre todo, las dobles negativas (DN) CD4- CD8- . Los datos de activación linfocitaria registrados en conjunto con la existencia de linfocitos T alo-específicos, sugieren la participación de la respuesta T en el fracaso del injerto.
Integration of omics and bioinformatics to identify new therapeutic targets for Acinetobacter baumannii. Virulence role of CarO in Acinetobacter baumannii infections
(2020-07-06) Labrador Herrera, Gema; Pachón Díaz, Jerónimo; Pachón Ibáñez, María Eugenia; Acedo Bécares, Alberto; Universidad de Sevilla. Departamento de Medicina
Acinetobacter baumannii remains a significant and difficult-to-treat pathogen that causes a range of interactions with the human host from asymptomatic colonization and carriage in the skin, intestinal tract, and respiratory tract to invasive infection, such as nosocomial pneumonia or bacteraemia. Especially, this pathogen affects critically-ill and immunocompromised patients admitted to Intensive Care Units (ICUs), causing them severe infections, which are associated with long hospital stay and high mortality rates. The success of this bacterium is due to a combination of several factors, highlighting its extraordinary ability to develop antimicrobial resistance that results in the rapid nosocomial spread of strains resistant to almost all known antimicrobials, including including the last reservoirs of our antimicrobial arsenal such as the carbapenems, worldwide. Thus, in the recent global priority list of antimicrobial-resistant bacteria of the World Health Organization, carbapenem-resistant A. baumannii (CRAB) is considered as a “critical priority” for the development of new antimicrobials, due to the lack of therapeutic options. This situation has promoted the search of new therapeutic strategies to deal with multidrug-resistant (MDR) A. baumannii strains displaying additional carbapenem-resistance, and non-antimicrobial approaches aimed at bacterial virulence factors may represent a promising alternative. Nevertheless, our knowledge on A. baumannii pathogenesis and virulence traits is still relatively scarce. In this Doctoral Thesis, and in order to stop the evolution of A. baumannii infections, we aimed to study more deeply the pathogenesis of CRAB infections using omics and bioinformatics to ultimately discover new therapeutic targets for anti-A. baumannii drugs. Firstly, we studied MDR/CRAB isolates from tracheobronchial aspirate samples of ICU adult patients who suffered A. baumannii bacteraemic ventilator-associated pneumonia (VAP) or remained exclusively colonised by this pathogen. We analysed the in vitro and in vivo virulence of these isolates, in order to know if the invasive isolates exhibited higher virulence than the colonising ones, but no differences were found. Moreover, when the whole-genome sequencing (WGS) data of these isolates were analysed following different approaches, again we did not find any difference between both phenotypes regarding their clonal relationship, antimicrobial resistance mechanisms, or known virulence determinants. However, the invasive A. baumannii isolates exhibited higher levels of expression of the outer membrane protein (OMP) OmpA than the colonising ones, suggesting that those phenotypes depend on the regulation of already-known or still unknown virulence factors, instead of on the genomic content. Secondly, six bacteraemic MDR/CRAB clinical isolates obtained from six clinically homogeneous ICU adult patients with bacteraemia secondary to VAP, who were subjected to optimal colistin treatment but with radically different clinical outcomes, were comparatively analyzed by WGS complemented with proteomic and immunoblot techniques. These analyses indicated that the carO gene, encoding for the second most abundant β-barrel protein of the A. baumannii outer membrane (OM), CarO, was interrupted by different disruptive events in the isolates from patients who recovered from infection, while it was intact in the isolates from patients who did not survive. When the virulence role of A. baumannii CarO was analyzed in model systems, an isogenic mutant lacking carO (ATCC 17978 ΔcarO) showed lower ability in vitro to adhere and invade cultured human lung epithelial cells, and exhibited a higher minimum lethal dose and a lower dissemination potential into essential organs and fluids in a murine model of peritoneal sepsis. All of the above deficiencies were reverted in the ATCC 17978 ΔcarO mutant transformed with a carO expression plasmid restoring OM CarO levels. Thus, the results presented here reveal a previously unnoticed virulence role for the A. baumannii OMP CarO, which may be responsible of the poor clinical outcome and therefore a potential target for the development of novel anti-A. baumannii drugs.
SIPIA-CT: stroke induced pneumonia in Andalucia: detección y validación de marcadores clínico - biológicos de neumonía asociada al ictus
(2020-06-24) Zapata Arriaza, Elena; Jiménez Hernández, María Dolores; Moniche Álvarez, Francisco; Montaner Villalonga, Joan; Universidad de Sevilla. Departamento de Medicina
Las infecciones respiratorias, y en especial la neumonía asociada al ictus (NAI), constituye la complicación médica más frecuente y uno de los principales factores responsables de mal pronóstico en pacientes con ictus. La predicción y el diagnóstico certero de dicha complicación presenta limitaciones en la actualidad, lo cual ha motivado en parte el fracaso de los ensayos clínicos orientados a demostrar el beneficio de la profilaxis antibiótica en estos pacientes. La predicción de la NAI está basada en escalas clínicas recientemente publicadas con buenas cifras de sensibilidad aunque no de especificidad, lo cual implica la necesidad de añadir otras herramientas como el uso de biomarcadores para la toma de decisiones clínicas. Estas escalas precisan de una validación externa en cohortes prospectivas, pero podrían suponer una aproximación válida para la estratificación del riesgo de sufrir una NAI en pacientes con ictus agudo. Igualmente el diagnóstico de NAI puede suponer un reto clínico al estar basado en síntomas inespecíficos en pacientes con ictus y en la utilización de la radiografía de tórax cuyo rendimiento diagnóstico es pobre en estos pacientes. Es por ello que recientemente, el grupo de estudio PISCES (Pneumonia In Stroke ConsEnSus) ha establecido criterios operacionales en la NAI para solventar dichas limitaciones. Validar dichos criterios y conocer su aplicabilidad es de vital importancia, ya que el tratamiento anti-infeccioso no es eficaz en estas condiciones, y este error en el diagnóstico podría ser responsable de los resultados negativos de los ensayos clínicos en profilaxis antibiótica. Es por ello que establecer un diagnóstico certero de neumonía asociada al ictus, mediante la validación de criterios clínicos a través de la utilización del TC de tórax usado como “gold standard”, permitirá mejorar los criterios diagnósticos de neumonía asociada al ictus (NAI) y así optimizar el tratamiento específico precoz. La combinación de escalas clínicas y biomarcadores sanguíneos, permitirá detectar de forma precoz a los pacientes con un mayor riesgo de sufrir una infección respiratoria tras el ictus. Para comprobar nuestra hipótesis de trabajo, realizamos dos estudios prospectivos observacionales, uno de ellos multicéntricos para realizar la validación externa de escalas clínicas predictoras de NAI así como los criterios diagnósticos PISCES y para la identificación de biomarcadores predictores de NAI utilizando como técnica diagnóstica la tomografía computerizada de alta resolución de tórax (TACAR). Tras la realización de dichos estudios, demostramos la elevada sensibilidad y especificidad para la detección de cualquier infección del tracto respiratorio y bronconeumonía de los criterios clínicos PISCES. Así mismo, nuestros resultados indican que las escalas A2DS2 e ISAN podrían ser las mejores en la identificación de pacientes con alto riesgo de infección respiratoria debido a su alta sensibilidad (tanto para cualquier infección respiratoria como para bronconeumonía). Por último en cuanto a los biomarcadores evaluados (MR-proADM, suPAR, SAA), los pacientes con NAI probable en base a criterios clínicos PISCES tendieron a presentar niveles más altos de MR-proADM a las 24 h y niveles más altos de suPAR a las 48 h. Sin embargo, con respecto a los hallazgos en TACAR de tórax, la MR-proADM a las 24 h y tanto suPAR como SAA a las 48 h se asociaron con la aparición de NAI. A las 24 h, un punto de corte de MR-proADM> 1.023 nmol / L tenía una sensibilidad del 80% y una especificidad del 72.2% para la neumonía. A las 48 h, tanto SAA> 25.15 mg / dL (60% de sensibilidad, 85.7% de especificidad) como suPAR> 3.14 ng / mL (80% de sensibilidad, 57.1% de especificidad) se asociaron con la presencia de infección. La combinación de SAA> 25.15 mg / dL y suPAR> 3.14 ng / mL a las 48 h tenía una sensibilidad del 80% y una especificidad del 95.8% cuando ambos biomarcadores estaban por encima del límite, y una sensibilidad del 60% y una especificidad del 94.1% cuando uno de ellos estaba por encima del límite. Por tanto, a la luz de todos los resultados, la integración de información clínica y biológica, mediante scores predictivos y biomarcadores plasmáticos, podría ser la respuesta al manejo de esta grave complicación. En estudios futuros, se debe establecer si el uso de estos biomarcadores por sí solos o asociados a criterios y escalas clínicas, resultan en una mejoría del pronóstico de los pacientes y/o una reducción del gasto sanitario.

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