Tesis (Microbiología y Parasitología)

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Estudio del efecto del aclaramiento de la colonización por pneumocystis jirovecii en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica
(2024-04-09) Gutiérrez Rivero, Sonia; Calderón Sandubete, Enrique José; Horra Padilla, Carmen de la; Morilla Romero de la Osa, Rubén; Universidad de Sevilla. Departamento de Enfermería; Universidad de Sevilla. Departamento de Medicina; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
INTRODUCCIÓN: la elevada prevalencia de colonización por Pneumocystis jirovecii en pacientes con EPOC, y las evidencias que muestran que el hongo induce alteraciones en la respuesta inflamatoria sistémica, sugieren un posible papel en la progresión de la EPOC. El objetivo del estudio es analizar la dinámica de colonización/aclaramiento por Pneumocystis en sujetos con EPOC estable, la posible implicación en la alteración de la respuesta inflamatoria y en la evolución de la EPOC. MATERIAL Y MÉTODOS: estudio de cohortes prospectivo observacional con seguimiento durante un año. Incluimos 53 pacientes con EPOC estable que cumplieron los criterios de inclusión, se descartaron infecciones respiratorias de otra etiología. De los 53 pacientes, se obtuvieron muestras respiratorias y séricas en la visita basal y a los 4 meses; adicionalmente, se obtuvieron muestras a los 8 meses en 22 pacientes; y a los 12 meses en 14 pacientes. P. jirovecii se identificó mediante PCR del gen mtLSUrRNA en esputo espontáneo. Se cuantificaron los niveles séricos de las citoquinas IL-1β, IL-8, IL-6, TNF-α, IFN-γ y la proteína MCP-1, así como las proteínas del surfactante pulmonar A y D. RESULTADOS: El 94.4% eran hombres, con una edad media de 71 años, el 87 % eran exfumadores y el 41.5% se encontraba en estadio IV de la GOLD. En la visita basal, el 41,5% estaba colonizados por P. jirovecii. Se identificaron cuatro patrones en la dinámica de colonización: A: sujetos que aclaraban en algún punto, B: pacientes colonizados en algún punto, C: persistían negativos en dos visitas consecutivas, y D: persistían colonizados en dos visitas consecutivas. El aclaramiento se observó en 25 ocasiones y la colonización en 14. Los pacientes colonizados presentaron niveles significativamente más elevados de IL-6, IL-8 y MCP-1. CONCLUSIONES: la colonización por P. jirovecii en sujetos con EPOC es un proceso dinámico que induce alteraciones en la respuesta inflamatoria sistémica del huésped colonizado que revertiría tras el aclaramiento, sugiriendo que P. jirovecii puede contribuir a la progresión de la EPOC.
Diversidad procariota en suelos hipersalinos del Paraje Natural de las Marismas del Odiel
(2024-01-26) Galisteo Gómez, Cristina; Sánchez-Porro Álvarez, Cristina; Ventosa Ucero, Antonio; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
La presente Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio de la diversidad procariota de ambientes hipersalinos terrestres a través de dos enfoques: dependiente e independiente de cultivo. En concreto, se han estudiado suelos hipersalinos del Paraje Natural de las Marismas del Odiel (Huelva). Con esta combinación de metodologías se han contrastado las diferencias y semejanzas en la biodiversidad obtenida en dicho hábitat extremo al estudiar las mismas muestras mediante dos técnicas alternativas. Para la realización de este estudio, se han obtenido un total de 26 muestras a lo largo de tres años consecutivos. El análisis de los parámetros fisicoquímicos de dichos suelos ha puesto de manifiesto que: (i) la conductividad eléctrica indica que los suelos son salinos; (ii) la concentración de ciertos metales pesados está por encima de los límites para suelos no contaminados por dichos metales pesados. Con respecta al análisis independiente de cultivo, se han secuenciado 18 metagenomas shotgun cuyos perfiles taxonómicos muestran unas proporciones similares entre los dominios Archaea y Bacteria. Destacan los filos “Euryarchaeota”, Pseudomonadota, Bacteroidota, Gemmatimonadota y Balneolota. Este análisis ha mostrado semejanzas con otros ambientes terrestres hipersalinos, mientras que los habitantes mayoritarios en hábitats acuáticos hipersalinos no se encuentran representadas en estos ambientes terrestres. Con respecto al análisis funcional de los metagenomas, se observó una abundancia de genes relacionados con el transporte de metales pesados. Dada la elevada salinidad de las muestras, se han estudiado las estrategias de osmoadaptación, observándose que los representantes del filo de arqueas “Euryarchaeota” poseen la estrategia salt-in, mientras que la población bacteriana presenta tanto este mecanismo, como la estrategia salt-out. También se han detectado genes relacionados con la biosíntesis de los solutos compatibles. A partir de los metagenomas se han reconstruido > 4.000 bins, de los cuales tan solo 11 poseen una calidad alta. Dada la elevada calidad de los parámetros genómicos de este grupo y el hecho de que muchos de ellos tan solo se puedan clasificar taxonómicamente a nivel de filo, indica que nos encontramos ante genomas de taxones no descritos. En segundo lugar, se han estudiado 14 muestras mediante técnicas dependientes de cultivo utilizando distintas condiciones y medios de cultivo. En total, se han aislado unas 4.000 cepas, de las que se han identificado 549 cepas, asignándose a los filos Actinomycetota, Balneolota y Pseudomonadota y “Euryarchaeota”, los cuales se corresponden con los identificados mediante metagenómica. No obstante, Bacillota fue el segundo filo con mayor número de aislados, mientras que en los metagenomas se encontraba como un grupo minoritario. Los porcentajes de identidad de 60 de dichas cepas indicaban que podrían constituir nuevos taxones. Algunas se han seleccionado para un estudio detallado, describiéndose cuatro especies y un género nuevos, Terrihalobacillus insolitus gen. nov., sp. nov., Pseudidiomarina terrestris sp. nov., Aquibacillus salsiterrae sp. nov. y Fodinibius salsisoli sp. nov., y se han reclasificado las especies del género Aliifodinibius dentro de Fodinibius. Por otro lado, se ha anotado la presencia de rutas de biosíntesis de vitaminas, así como mecanismos de adaptación a los metales pesados y la elevada salinidad. El análisis de la distribución ecológica de los nuevos taxones, excepto Fodinibius, indica que se trata de microbiota minoritaria en los ambientes hipersalinos. En definitiva, la diversidad procariota presente en los suelos hipersalinos del Paraje Natural de las Marismas del Odiel es tan variada que es necesario utilizar conjuntamente las técnicas dependientes e independientes de cultivo. Asimismo, nuestro estudio muestra que muchos de los taxones que habitan estos ambientes extremos no se han descrito anteriormente, y que algunos presentan funciones de gran relevancia.
Desarrollo y validación de métodos inmunológicos para la estimación del gluten consumido y sus aplicaciones en la enfermedad celiaca
(2023-12-04) Mendia Azkoaga, Irati; Cebolla Ramírez, Ángel; Sousa Martín, Carolina; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
La enfermedad celiaca (EC), se define como una enteropatía inflamatoria crónica del intestino delgado causada por la ingesta de gluten en individuos genéticamente predispuestos. Por tanto, es el resultado de la interacción del gluten con factores inmunológicos, genéticos y ambientales. Afecta aproximadamente al 1,4% de la población, aunque su prevalencia puede variar en función de la edad, el continente y la región. Esta patología está infradiagnosticada a nivel mundial ya que los criterios utilizados en los diferentes estudios epidemiológicos para su diagnóstico no son uniformes, así por ejemplo el estudio serológico, en adultos, requiere confirmación histológica. Las proteínas del gluten están presentes en el trigo, la cebada, el centeno la avena y sus derivados, y se degradan de forma deficiente en el tracto gastrointestinal ya que son resistentes a las enzimas digestivas. Tras la ingestión de alimentos con gluten se generan péptidos inmunogénicos que son capaces de producir daño en la mucosa intestinal con una lesión que se caracterizada histológicamente por infiltrado de linfocitos intraepiteliales e hiperplasia de las criptas con distintos grados de atrofia de las vellosidades intestinales, El cuadro clínico de la EC es heterogéneo, presenta una gran variedad de síntomas que pueden ser tanto gastrointestinales como extraintestinales, y que difieren considerablemente en función de la edad de presentación. La actual forma recomendada para el diagnóstico de la EC se basa en un flujo de pruebas, donde las primeras suelen ser las serológicas. No obstante, estas pruebas de diagnóstico sólo son válidas para detectar la enfermedad en aquellas personas que consumen gluten de forma regular y sin restricción en su dieta. Una vez efectuado el diagnóstico, la única terapia disponible es la adhesión a una dieta sin gluten (DSG) de por vida. No obstante, la completa exclusión del gluten de la dieta es complejo y las transgresiones dietéticas, tanto voluntarias como involuntarias, son frecuentes. Por ello, una monitorización continua del paciente para asegurar una correcta adherencia a la DSG resulta necesaria. Para la monitorización clínica de esta patología las guías clínicas recomiendan que en la práctica clínica se realicen de forma periódica pruebas serológicas, estudios de la sintomatología, cuestionarios dietéticos y biopsias intestinales. Sin embargo, se ha demostrado que estas herramientas son poco eficientes, invasivas o inexactas para evaluar la adherencia a la DSG. Por lo que contar con herramientas fiables para la monitorización de la DSG de forma eficiente y no invasiva es vital. En los años 2012 y 2017 se publicaron unos estudios con los que se abría la posibilidad de utilizar la determinación de los péptidos inmunogénicos del gluten (GIP) en heces y orina, respectivamente, como marcadores directos de la ingesta de gluten, ya que permiten monitorizar la adherencia a la DSG en pacientes con EC. La recuperación de cantidades medibles de GIP en estas excreciones corporales indica de forma directa que el gluten ha pasado por el tracto digestivo y, que, por lo tanto, es al menos parcialmente resistente a la digestión gastrointestinal humana, además de que puede absorberse y acceder al torrente sanguíneo. Estas herramientas de diagnóstico o seguimiento requieren para su amplia aplicación en la rutina clínica en la Unión Europea del marcado IVD (Diagnostico In Vitro) y CE (Conformidad Europea). En este contexto, esta tesis doctoral se ha centrado en el desarrollo y validación de nuevas metodologías analíticas en ELISA e inmunoensayos de flujo lateral con soluciones alternativas para facilitar el diagnóstico de la EC y la detección de la ingesta de gluten, así como el alcance de sus aplicaciones. El Capítulo 1 es una introducción general sobre los trastornos relacionados con el consumo de gluten, con especial atención a la EC, y sobre inmunoensayos para la detección del gluten y GIP detallando además los factores a tener en cuenta durante el desarrollo y la validación de los mismos. En el Capítulo 2 se exponen los antecedentes del tema y los objetivos principales de esta Tesis Doctoral. El Capítulo 3 incluye la validación del iVYCHECK GIP Urine, un IEFL de uso en el seguimiento de la DSG mediante la detección de los GIP para su conformidad con el reglamento 746/2017 con el objetivo de poder obtener el marcado CE IVD. En el Capítulo 4 se demuestra la utilidad clínica en atención primaria del CeliacDetect, un IEFL para la detección de anti-tTG-IgA en sangre, para la detección precoz de la EC mediante cribado en población pediátrica, y explorar, la conveniencia de monitorizar el consumo de gluten reciente para hacer más eficaces dichos diagnósticos. El Capítulo 5 describe el desarrollo de un método ELISA para la detección de GIP en orina y sus aplicaciones durante el diagnóstico y seguimiento de la EC. Por último, en el Capítulo 6, contiene las conclusiones alcanzadas en esta Tesis Doctoral.
Inhibición de la actividad ATPasa del complejo SWI/SNF: cambios cromatínicos y de la expresión génica
(2023-06-12) Basurto Cayuela, Laura; García Domínguez, Mario; Reyes Rosa, José Carlos; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
Los complejos SWI/SNF fueron la primera maquinaria de remodelación de cromatina dependiente de ATP descubierta y están compuestos por 11-15 proteínas diferentes en mamíferos. Su actividad enzimática la llevan a cabo dos ATPasas mutuamente excluyentes, denominadas BRM (SMARCA2) y BRG1 (SMARCA4). Recientemente se ha desarrollado una nueva molécula que inhibe la actividad de BRG1 y BRM, denominada BRM014, y que, por lo tanto, inhibe a todos los complejos SWI/SNF. Sorprendentemente, este inhibidor solo afecta la expresión de aproximadamente el 10% de los genes expresados en la línea no cancerosa de epitelio mamario de ratón NMuMG. Hemos investigado las características estructurales y transcripcionales, así como el entorno cromatínico de los genes dependientes e independientes de SWI/SNF. Se ha mostrado que la accesibilidad del 90% de los promotores de genes activos de la línea NMuMG no se ve afectada tras el tratamiento con BRM014, mientras que aproximadamente el 56% de otros elementos regulatorios distales en cis si cambian. Describimos que en ausencia de la actividad SWI/SNF ocurre una fuerte ocupación nucleosomal de elementos regulatorios con claras características de enhancers. En un pequeño grupo de promotores la inhibición de SWI/SNF provoca un uso alternativo de inicios de la transcripción y un aumento de la transcripción antisentido a partir de promotores. Por otro lado, nuestros datos no muestran un defecto general en la eficiencia de splicing en ausencia de de la actividad SWI/SNF. Finalmente, observamos que, BRM014 afecta el nivel basal de expresión de genes relacionados con la transición de epitelio a mesénquima (EMT) y las vías de transducción de señales RAS. Además, BRM014 afecta fuertemente la inducción dependiente de TGFβ de la EMT, proceso implicado en la formación de metástasis.
Taxonomía molecular y filogenia de especies de trichuris parásitas de hospedadores vertebrados
(2023-06-16) Rivero Fernández, Julia; Callejón Fernández, Rocío; Cutillas Barrios, Cristina; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
El principal objetivo de la presente Tesis Doctoral ha sido llevar a cabo un estudio taxonómico y filogenético de diferentes especies del género Trichuris parásitas de distintos hospedadores, principalmente primates no humanos (PNH), junto con otros hospedadores vertebrados, de diferentes parques zoológicos de España. Los resultados obtenidos aportarán nuevos datos de este género para clarificar la taxonomía actual y las relaciones filogenéticas de este grupo de parásitos y para su lucha y control. El desarrollo de la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo en varias etapas: 1. Recogida de muestras: Para ello se recogieron muestras de heces de distintos hospedadores de diferentes parques zoológicos de España: primates, camellos, puercoespines, etc. 2. Estudio morfológico y biométrico clásico: Para llevar a cabo la determinación taxonómica por procedimientos clásicos. Se realizó un estudio morfo-biométrico inicial basándonos en los parámetros más característicos citados por distintos autores de las poblaciones de Trichuris de adultos obtenidas. 3. Estudio mediante morfometría geométrica: Para analizar si es una herramienta útil en la identificación y diferenciación de las diferentes especies de Trichuris analizadas. 4. Estudio molecular: taxonómico y filogenético. El estudio molecular de las distintas especies del género Trichuris se realizó en varias etapas: extracción de ADN; amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de diferentes marcadores moleculares; purificación del productor de PCR; cuantificación del ADN; y secuenciación. Todo ello con el fin de estudiar diferentes marcadores moleculares ribosómicos, mitocondriales y del genoma mitocondrial completo de las distintas especies objeto de estudio. Una vez obtenidas las secuencias se alinearon y analizaron filogenéticamente basándonos en tres parámetros fundamentales: - La variabilidad interespecífica de las secuencias - La variabilidad interpoblacional - La variabilidad intrapoblacional 5. Análisis mediante la técnica MALDI-TOF MS de un gran número de muestras pertenecientes a distintas especies del género Trichuris procedentes de distintos hospedadores vertebrados. Los resultados obtenidos nos permitieron crear una base de datos interna con los espectros de referencia para cada una de las especies analizadas, con el fin de identificarlas y clasificarlas.
Diseño de consorcios bacterianos potenciadores de la nodulación para la recuperación de estuarios degradados por estreses abióticos utilizando Medicago sativa
(2023-05-18) Flores Duarte, Noris J.; Navarro de la Torre, Salvadora; Rodríguez Llorente, Ignacio David; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
El deterioro de los suelos es uno de los problemas más acuciantes en la actualidad. Distintos tipos de estrés abiótico están presentes en suelos agrícolas y estuarinos que antes eran idóneos para cultivos y presentaban una gran biodiversidad. El manejo inadecuado de fertilizantes químicos, la salinidad, los metales pesados y otros contaminantes han contribuido a la pérdida de nutrientes y microorganismos que aportan beneficios a los suelos. En Huelva (Andalucía, España) se encuentran estuarios con gran importancia ecológica y económica, como el conjunto de estuarios de los ríos Tinto y Odiel, muy estudiados por ser una de las regiones con mayor contaminación por metales pesados del mundo, y el estuario del río Piedras, con zonas descritas como suelos pobres en nutrientes. Para poder contrarrestar el daño causado por estos estreses abióticos se han propuesto alternativas biotecnológicas de biorremediación, más sostenibles con el medio ambiente y más económicas que los tratamientos de remediación físico-químicos convencionales. En este sentido, las leguminosas son una excelente opción para recuperar suelos degradados que se encuentran expuestos a estrés abiótico, a través de la fijación biológica de nitrógeno. Estas plantas son idóneas para la fitoestabilización de metales pesados, y las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB, Plant Growth Promoting Bacteria) se pueden utilizar como inoculantes para mejorar el crecimiento, la nodulación y, en definitiva, la adaptación de las leguminosas a los suelos contaminados. Las medidas de minerales y macronutrientes realizadas en las marismas del río Piedras mostraron una deficiencia nutricional y un bajo contenido de materia orgánica, convirtiéndolo en un suelo degradado medioambientalmente. Por otro lado, la concentración de metales/loides presentes en los suelos del estuario del río Odiel sobrepasaron los valores permitidos por la legislación autonómica y estatal en parques naturales, suelos agrícolas e industriales. En esta Tesis Doctoral se propone la utilización de microorganismos autóctonos, incluyendo bacterias rizosféricas, endófitas no rizobios asociadas al nódulo y rizobios, con propiedades que promueven el crecimiento de la planta (PGP) para mejorar el crecimiento y la adaptación de plantas de Medicago sativa, así como incrementar su capacidad de fitoestabilizar metales, para la recuperación de los suelos estuarinos degradados y/o contaminados. Se aislaron rizobacterias y bacterias endófitas cultivables de nódulos de plantas de Medicago spp. que crecen en las marismas de los ríos Piedras y Odiel, respectivamente. La selección de las bacterias para realizar experimentos in vitro y en condiciones de invernadero se realizó en base a sus propiedades PGP como las auxinas, ACC desaminasa y la formación de biofilm entre otras, la presencia de enzimas líticas, entre ellas la quitinasa, pectinasa y amilasa entre otras, y la resistencia a metales pesados. Las bacterias endófitas seleccionadas fueron dos Pseudomonas (Pseudomonas sp. N4 y Pseudomonas sp. N8) y dos rizobios (Ensifer sp. N10 y Ensifer sp. N12) y tres rizobacterias (Pseudomonas sp. L1, Chryseobacterium soli L2 y Priestia megaterium L3). También se seleccionaron tres bacterias de colección por sus propiedades PGP y la resistencia a metales. Estas últimas incluyen Ensifer medicae MA11, un rizobio que nodula Medicago spp., y dos endófitos del género Variovorax (V. paradoxus S110T y V. gossypii JM-310T). Se emplearon inoculantes individuales, combinaciones rizobacterias-rizobios o rizobios-endófitos, y se diseñaron tres consorcios bacterianos compuestos por tres rizobacterias (Pseudomonas sp. L1, Chryseobacterium soli L2 y Priestia megaterium L3) y un rizobio (Ensifer medicae MA11; CSL), el mismo rizobio (Ensifer medicae MA11) y los dos endófitos del género Variovorax (V. paradoxus S110T y V. gossypii JM-310T; CSV) y, por último, un consorcio compuesto por dos endófitos no rizobios (Pseudomonas sp. N4 y Pseudomonas sp. N8) y dos rizobios autóctonos (Ensifer sp. N10 y Ensifer sp. N12; CSN). Estas inoculaciones mejoraron la germinación, la nodulación y el crecimiento de las plantas en experimentos in vitro. En condiciones de invernadero con suelos de los estuarios mejoraron la nodulación, el estado fisiológico de la planta, los parámetros fotosintéticos, el contenido de clorofila y nitrógeno, la respuesta al estrés de la planta, además de mejorar la acumulación de metales en las raíces M. sativa en suelos degradados con niveles de moderados a altos de contaminación. Partiendo de la mencionada propuesta, en esta Tesis Doctoral se ha demostrado que las inoculaciones de M. sativa con los consorcios bacterianos compuestos por rizobios y endófitos resistentes a metales o rizobacterias con propiedades PGP son herramientas útiles para la fitoestabilización de metales/oides y para promover el crecimiento de leguminosas en suelos con distintos tipos de estrés abiótico, contribuyendo a la recuperación de estos ecosistemas. Con esta estrategia se garantiza, además, una mínima translocación de metales a la parte aérea de las plantas, por lo que podrían utilizarse, además de en estrategias de fitoestabilización de metales, como plantas forrajeras.
Phenotypic heterogeneity in Salmonella enterica: biological implications of a phase-variable system
(2023-02-03) Fernández Fernández, Rocío; Sánchez Romero, María Antonia; Beuzón López, Carmen del Rosario; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
Esta tesis está basada en investigaciones previas de nuestro grupo de investigación sobre el operón opvAB de Salmonella enterica. La transcripción de este locus está sujeta a variación de fase y genera dos subpoblaciones de células que presentan diferencias fenotípicas en la longitud del antígeno O del lipopolisacárido: la subpoblación OpvABOFF, que tiene el antígeno O estándar, y la subpoblación OpvABON, que exhibe un antígeno O más corto. El operón opvAB está presente en la especie S. enterica y ha sido identificado en las subespecies arizonae, diarizonae, salamae y enterica en una única copia dentro del mismo contexto cromosómico. La secuencia opvAB de S. enterica está muy conservada en comparación con la secuencia de otros operones que codifican estructuras de superficie, como los locus std y gtr. La diversidad observada en el locus opvAB está relacionada principalmente con sustituciones y los elementos cruciales en la regulación de la expresión de opvAB se encuentran conservados casi en el 100% de las secuencias. Al analizar los mecanismos de selección natural, los resultados indican que la selección purificadora podría estar actuando sobre ambos genes del locus, opvA y opvB. El mecanismo de selección purificadora está generalmente asociado con una disminución de la diversidad de la secuencia y no sería lo esperado para un locus que codifica proteínas de las envolturas celulares, como es el opvAB. Sin embargo, dado que los elementos básicos de la secuencia reguladora se encuentran altamente conservados, el mecanismo de variación de fase se mantiene seleccionado. La variación de fase del locus opvAB podría ser suficiente para generar una diversidad fenotípica en las envolturas celulares que permitiera su adaptación a diversos ambientes. Este mecanismo de variación epigenética podría considerarse una estrategia adaptativa alternativa a la selección diversificadora que actúa sobre otros loci relacionados con los antígenos de superficie. Los experimentos de evolución en el laboratorio revelaron que, tras casi doscientas generaciones en presencia constante de fago, la variación de fase de opvAB se pierde y el mecanismo de resistencia a fagos es predominantemente mutacional. En cambio, cuando el contacto con fagos es fluctuante, la biestabilidad de opvAB se mantiene transcurridas un número similar de generaciones. Así mismo, los resultados de esta tesis mostraron que la versatilidad y reversibilidad en la expresión del operon opvAB permiten una adaptación rápida cuando las poblaciones bacterianas se enfrentan a multitud de situaciones ambientales (supervivencia en suero y proliferación celular en macrófagos fueron estudiadas). Estas observaciones ilustran el valor adaptativo de la heterogeneidad fenotípica generada por la variación epigenética como una estrategia para evitar la mutación. Además, nuestro estudio proporciona apoyo experimental a los modelos teóricos basados en la teoría de juegos que predicen que la heterogeneidad fenotípica resulta muy costosa en ambientes constantes, pero es beneficiosa en ambientes cambiantes. Finalmente, esta tesis aborda la importancia de la longitud del antígeno O del lipopolisacárido en la supervivencia de Salmonella en presencia de diferentes compuestos antimicrobianos. Dependiendo de las propiedades del antibiótico, las células con el antígeno O normal (OpvABOFF) o más corto (OpvABON) presentan diferencias en cuanto a su comportamiento en presencia del antimicrobiano. Curiosamente, en presencia de algunos antibióticos, el mantenimiento de las dos subpoblaciones fenotípicamente diferentes (OpvABOFF y OpvABON) resulta beneficioso para la supervivencia de la población. En estos casos, se ha observado la aparición de una estructura bacteriana organizada, compatible con la de un biofilm. Nuestros hallazgos nos llevan a sugerir que esta estructura bacteriana formada por células OpvABOFF y OpvABON podría presentar funciones especializadas que determinarán un mayor grado de protección de las células de Salmonella al antibiótico presente en el medio. Por lo tanto, la formación de biofilms dependiente de variación de fase podría ser agregada a la lista de factores que limitan la eficacia de los tratamientos antibióticos contra Salmonella.
Desarrollo y uso de herramientas útiles en el manejo de la enfermedad celiaca y complicaciones asociadas
(2022-12-22) Sánchez Muñoz, Diego; Moreno Amador, María de Lourdes; Sousa Martín, Carolina; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
La Enfermedad Celiaca (EC) es una patología crónica inflamatoria con afectación del intestino delgado provocada por la ingesta de gluten en personas genéticamente predispuestas. El único tratamiento disponible en la actualidad es el seguimiento de una dieta sin gluten (DSG) durante toda la vida. Se ha demostrado que una adherencia estricta a la DSG es fundamental para eliminar los síntomas de la enfermedad, evitar deficiencias nutricionales, recuperar la mucosa intestinal y mejorar la calidad de vida (CV) de estos pacientes. Una proporción relativamente baja de pacientes con EC presentan lo que se conoce como Enfermedad Celiaca No Respondedora (ECNR) que cursa con síntomas y atrofia vellositaria duodenal a pesar de realizar una dieta exenta de gluten. Entre las causas de la ECNR se ha descrito la exposición al gluten, el síndrome de intestino irritable, la Enfermedad Celíaca Refractaria (ECR), la intolerancia a la lactosa y la colitis microscópica, así como el sobrecrecimiento bacteriano intestinal, la insuficiencia pancreática y la intolerancia a la fructosa. De todas estas causas, la que peor pronóstico y evolución tiene es la ECR que se define como una enteropatía grave persistente con malabsorción sintomática, tras el seguimiento de una DSG estricta, y que requiere el tratamiento con corticoides e inmunosupresores, entre otros. Por tanto, el correcto diagnóstico de la ECR se convierte en un paradigma fundamental en los pacientes con EC. El seguimiento nutricional, serológico y anatomopatológico forma parte de las directrices para el diagnóstico de la ECR, sin embargo, las metodologías existentes para la evaluación del seguimiento nutricional de la DSG son subjetivas, y no detectan de forma directa el gluten consumido. La determinación de los péptidos inmunogénicos de gluten (GIP) en muestras de heces y orina es una herramienta sensible, específica y objetiva y no invasiva para la verificación del estricto cumplimiento de la DSG en los pacientes con EC en comparación con la serología, los cuestionarios dietéticos, la sintomatología y la biopsia intestinal, que carecen de al menos de una de estas propiedades. Por tanto, la determinación de GIP podría ayudar también al seguimiento de la DSG en pacientes con ECNR y ECR, contribuyendo al mejor cumplimiento de esta, y al cambio en el pronóstico de la evolución de la EC. Es indudable el impacto negativo que tiene la EC, al igual que otras enfermedades crónicas, en la CV de estos pacientes, no solo por la patología en sí, sino también por la necesidad de la adherencia a la DSG y las connotaciones sociales, físicas, psicológicas y económicas que ello conlleva. La medición de la CV se convierte así en un elemento prioritario para la evaluación de las áreas que afectan al paciente y así emprender acciones que reduzcan el impacto en su CV. Los cuestionarios genéricos son imprecisos ya que no tienen en cuenta las connotaciones especiales de esta enfermedad, y por ello son necesarias herramientas y cuestionarios específicos para la EC. Resulta incuestionable la necesidad además de la adaptación cultural e idiomática y, asimismo, la adaptación según el grupo de edad del paciente. Actualmente, existen cuestionarios diferenciados orientados a la población pediátrica y adultos, pero no hay herramientas específicas que evalúen la CV en pacientes con EC en la etapa adolescente. El trabajo realizado en esta Tesis Doctoral se ha centrado, en primer lugar, en el uso de la metodología de detección de GIP en orina para evaluar la adherencia real a la DSG de los pacientes con ECR como parte estratégica del diagnóstico. En segundo lugar, se ha desarrollado un cuestionario en español específico de la CV para la EC mediante la traducción, adaptación cultural y validación del “Celiac Disease Questionnaire (CDQ)”. Se ha evaluado la CV mediante este cuestionario en pacientes celiacos tanto adultos como en adolescentes en España con el objetivo de detectar áreas afectadas, y establecer diferencias de necesidades entre subgrupos. El Capítulo 1 es una introducción general sobre la EC y la ECR. El Capítulo 2 comprende una revisión actualizada sobre los avances más relevantes en la fisiopatología, el diagnóstico, manejo clínico de la EC, y de otras patologías relacionadas con el gluten, así como de la educación nutricional de los pacientes que padecen esta patología. En el Capítulo 3 se exponen los antecedentes del tema y los objetivos principales de esta Tesis Doctoral. En el Capítulo 4 se ha evaluado la determinación de GIP en orina de pacientes catalogados con ECR como metodología para el seguimiento de la adherencia a la DSG, y se ha establecido un algoritmo en el diagnóstico de la ECR para diferenciar los pacientes que son verdaderos refractarios de los “expuestos al gluten”. En el Capítulo 5 se ha diseñado un cuestionario CDQ en español mediante la traducción, adaptación cultural y validación del cuestionario francés de referencia, y se ha evaluado la CV de los pacientes españoles con EC tanto adultos como adolescentes, identificando las áreas más afectadas, así como las diferencias entre los grupos poblacionales para abordar acciones que reduzcan el impacto de la DSG. En el Capítulo 6 se resumen y discuten los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral, abordando la aplicación clínica de la detección de GIP en orina para el seguimiento de la DSG en pacientes con ECR, y evaluando la utilidad de los cuestionarios específicos de CV de la EC para identificar las áreas más comprometidas en diferentes grupos poblacionales de celiacos. Por último, en el Capítulo 7, se incluyen las conclusiones alcanzadas en esta Tesis Doctoral.
Systems metabolic engineering in the halophilic bacteria Chromohalobacter salexigens for overproduction of ectoines
(2022-10-06) Martínez Martínez, Lourdes; Argandoña Bertrán, Montserrat; Vargas Macías, Carmen; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
The halophilic broad salt-gi owing bacterium Nfiromofio/o#octer solezipens is a natui al producer of ectoines, compatible solutes with piomising biotechnological applications as power ful biostabilizei s in Biomedicine, kJolecular Biology, and Dermopharmacy, among other s. These solutes are synthesized and intracellularly accumulated by this bacterium, in iesponse to increasing salinity in the external medium, and thus adapting its metabolism to support this biosynthetic route. Due to the complex regulation of this metabolic adaptation, novel metabolic engineering appi oaches based on Systems Biology (omics analysis and genome-scale metabolic models) that allows the rational rewiring of cell metabolism to inci ease bioproduction have been applied for ectoines overproduction. To accomplish this purpose, in this Doctoral Thesis a piuned genome-scale metabolic model of this bacterium, obtained from a pievious one (iFP764), was iefined and used to piedict potential genetic targets by using differ ent algorithms. As a iesult, they suggested a set of genes to knockout and/or to be up/down-regulated to obtain overpioducing str ains at high and low salinities. In order to 3n s3/ico analyze the effect of these peitui Nations in the distribution of metabolic fluxes, additional computational methods were successfully applied to simulate the cellular metabolic iesponse at different salinities in mutant str ains of N. solezipens. kJoi eover, an integrative analysis of multiomics data derived from ti anscriptomic, pioteomic and metabolomics, obtained at differ ent conditions of salinities and temperatui e, was also car ried out to find metabolic cori elations that could complement these analysis. Furthermore, a number of new genetic tools have been impi oved and developed in this work to assist in the /u r/ro implementation of some of the genetic modification str ategies predicted by the metabolic model. Finally, multiple knockout mutants of U. sa/ez/peus were obtained and phenotypically char acterised by deter mining their growth and intracellular ectoines accumulation profiles at differ ent salinities. A significant increase in ectoines production (measui ed as yield and specific pioduction i ates) was found in some of the single and multiple mutant str ains indicating that the metabolic model is capable to efficiently simulate 3n si/ico the metabolism of N. soleziqens, and thus being able to piedict ectoine-over producing strains. These findings would be of great value for the improvement of the biotechnological exploitation of ectoines.
Caracterización de productos empleados en la fabricación de medicamentos de terapias avanzadas
(2022-10-19) Bermejo González, María; Oyonarte Gómez, Salvador; Santos González, Mónica; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
En los últimos años ha habido un incremento en el desarrollo de terapias celulares para uso clínico. El suplemento del medio de cultivo celular más empleado hasta el momento ha sido el Suero Fetal Bovino (FBS). Sin embargo, su uso conlleva riesgos tales como la transmisión de patógenos bovinos, la presencia de xeno anticuerpos, así como problemas éticos y altos costes durante su obtención. El lisado plaquetario (hPL) ha demostrado ser un sustituto eficiente y seguro al FBS, empleado como suplemento del medio de cultivo de células destinadas al uso clínico, así como para la fabricación de medicamentos de terapias avanzadas. Sin embargo, aún no existe un consenso sobre su producción, lo cual conlleva una gran variabilidad entre los lotes fabricados y consecuentemente, sobre su acción biológica. Por otro lado, el uso de derivados sanguíneos requiere de la aplicación de métodos que aseguren la reducción de patógenos. Estos métodos deben ser aplicados sobre los materiales de partida o los productos finales, lo cual podría modificar la composición final y la calidad de los productos obtenidos. Los objetivos de este trabajo han sido desarrollar un método de fabricación óptimo, el establecimiento de controles y la caracterización de un lisado plaquetario humano que cumpla con los estándares de calidad establecidos por las Agencias Reguladoras como materia prima de medicamentos de terapias avanzadas. Nuestros resultados indican que el proceso de fabricación puede optimizarse evitando pasos de concentración plaquetaria, suplementando el producto con una cantidad de plasma adecuada y aplicando tres ciclos de congelación/descongelación, asegurando la calidad de los productos. La concentración de proteínas totales, albúmina, inmunoglobulinas, PDGF-AB y medidas de pH, han demostrado ser parámetros adecuados para la caracterización de las soluciones y por lo tanto, pueden ser establecidos como test de identidad. La aplicación de un sistema de reducción de patógenos basado en la combinación de riboflavina y luz ultravioleta sobre muestras de plasma y plaquetas, no afecta a la actividad biológica de los lisados plaquetarios (LP2i) a pesar de alterar su composición de forma significativa. En cuanto a los estudios de estabilidad, nuestros datos demuestran la estabilidad de las soluciones almacenadas a -20ºC (LP1) y a -20ºC y -80ºC (LP2 y LP2i) durante 24 meses. Los materiales de partida empleados (plasma y plaquetas) también se mantuvieron estables en el tiempo de almacenamiento analizado, aunque disminuyó significativamente el nivel de PDGF-AB en plaquetas almacenadas durante 13 meses. Con este trabajo de tesis concluimos que nuestro lisado plaquetario humano calidad GMP es una alternativa eficaz, que puede ser empleada de forma segura como suplemento del medio de cultivo celular o como medicamento de terapias avanzadas.
Control de la adherencia a la dieta sin gluten mediante la detección de péptidos inmunogénicos de gluten (GIP) en orina: concordancia con el daño histológico en mucosa duodenal de pacientes con enfermedad celiaca
(2021-09-23) Garzón Benavides, Marta; Pizarro Moreno, Ángeles; Sousa Martín, Carolina; Universidad de Sevilla. Departamento de Medicina; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
Estudio de los metalorreguladores Fur en la bacteria extremófila Chromohalobacter salexigens: implicación en la homeostasis del hierro y en la síntesis de ectoínas
(2021-09-10) Naranjo Fernández, Emilia; Argandoña Bertrán, Montserrat; Vargas Macías, Carmen; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
Chromohalobacter salexigens es un microorganismo extremófilo modelo de máximo interés y aplicabilidad en Biotecnología Microbiana, ya que sintetiza en respuesta a estrés osmótico y/o por temperatura, los solutos compatibles ectoína e hidroxiectoína, compuestos con propiedades estabilizadoras por lo que son de gran interés en Dermofarmacia, Biología Molecular, Agricultura o Biomedicina. La síntesis de ectoínas y su regulación es un proceso en el que intervienen complejos mecanismos transcripcionales y postranscripcionales, además de la implicación de reguladores globales y específicos. Por otro lado, se ha puesto de manifiesto la importancia de la regulación de la homeostasis del hierro en la adaptación a la salinidad, y por tanto en la síntesis de estos solutos. Así, el regulador global Fur es el encargado de mantener un control preciso de los niveles de hierro intracelulares existiendo, en C. salexigens, dos parálogos pertenecientes a la superfamilia Fur, Fur1 y Fur2. Además, para poder sintetizar la cantidad necesaria de estos solutos en condiciones de estrés, en C. salexigens se produce una adaptación metabólica en función de la salinidad y temperatura, ya que la síntesis de ectoínas depende de intermediarios procedentes de rutas del metabolismo central. Así, para poder dilucidar posibles modificaciones genéticas que permitan la obtención de cepas mejoradas en la producción de estos compuestos, se hace necesario un estudio más global e integrado tanto del metabolismo, como de los reguladores implicados en dicho proceso, así como de otros factores ambientales que puedan intervenir. En los últimos años se ha desarrollado un modelo metabólico de C. salexigens a escala genómica, que permitirá la predicción de estrategias de Ingeniería Metabólica para optimizar la producción de ectoínas en este microorganismo. Para la mejora de este modelo se está desarrollando un modelo de regulación que integre tanto las redes de señalización como las redes transcripcionales responsables de la adaptación metabólica y de la síntesis de ectoínas. Para ello se hace necesario el estudio, tanto a nivel molecular como global, de reguladores clave, como son los metalorreguladores Fur. En este trabajo se ha profundizado en el estudio sobre la homeostasis del hierro y su relación con la salinidad y temperatura, así como de su regulación, poniendo de manifiesto la importancia del hierro en la osmo- y termoadaptacion, y, por tanto, en la acumulación de solutos compatibles en C. salexigens. Además, se profundizado en la caracterización molecular de los dos metalorreguladores globales de la familia Fur, Fur1 y Fur2. Nuestro estudio ha demostrado que ambos están implicados en la regulación de la homeostasis del hierro, en función de salinidad y temperatura, así como en la osmo y termoadaptación, mediante el control transcripcional de la síntesis de ectoínas, pudiendo actuar tanto como activadores o inhibidores según la salinidad, temperatura y concentración de hierro extracelular. Esta conexión entre la homeostasis del hierro, la adaptación a elevada temperatura y la síntesis de solutos compatibles, es de especial relevancia, ya que se ha descrito en muy pocos organismos. En relación a su influencia a nivel global, experimentos de RNAseq en diferentes condiciones de salinidad, muestran que la eliminación tanto de fur1 como de fur2 afectó a la expresión del 40% de los genes, tanto a baja como a elevada salinidad, todos ellos pertenecientes a distintas categorías funcionales COG, mostrando el gran impacto sobre la fisiología de C. salexigens de ambos reguladores Fur. Entre los genes afectados, destacan los más de 50 genes que codifican reguladores transcripcionales, entre ellos algunos factores Sigma, sugiriendo que tanto Fur1 como Fur2 son reguladores globales, pero además sugiere su posición en un nivel superior dentro de la jerarquía de regulación, lo que explicaría el elevado número de genes que se ven afectados en su expresión. Por otro lado, uno de los aspectos más destacados que revelaron los estudios de RNAseq fue la implicación de los reguladores Fur en el metabolismo central. Así los genes relacionados con la respuesta metabólica controlados por el regulador Fur1 fueron 278 genes a baja salinidad y 255 genes a elevada salinidad, mientras que en relación al regulador Fur2, se observaron 254 genes diferencialmente expresados a baja salinidad, frente a los 187 genes a elevada salinidad. Las rutas donde se concentraron el mayor número de genes afectados fueron aquellas relacionadas con el metabolismo energético, el metabolismo de aminoácidos y el metabolismo de carbohidratos. Además, se ha observado que ambos reguladores también intervienen de forma importante en el control de procesos de transporte y metabolismo del hierro y zinc en función de las condiciones de salinidad, así como en la osmoadaptación, ya que parece que ambos reguladores intervienen no sólo en la síntesis, sino también en el transporte y degradación de los principales solutos compatibles, entre ellos las ectoínas. Por todo ello, los reguladores Fur1 y Fur2 se pueden postular como reguladores globales de la bacteria C. salexigens, implicados no solo en el control del metabolismo de las ectoínas, sino también en la adaptación metabólica y fisiológica de dicha bacteria a la osmolaridad del medio.
Evaluación de la actividad antimicrobiana de entidades químicas no convencionales para su uso en dermatología veterinaria
(2021) Pérez-Aranda Redondo, María; Alcudia Cruz, Ana; Pajuelo Domínguez, Eloísa; Universidad de Sevilla. Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
El desarrollo de multirresistencias a antibióticos por parte de las bacterias es un problema médico cuya incidencia ha aumentado de manera exponencial, sobre todo en las últimas décadas. Realmente, se trata de un mecanismo adaptativo a modo de respuesta de los microorganismos ante el enfrentamiento reiterado a fármacos antimicrobianos, con objeto de eludir su acción. En consecuencia, este hecho ha generado un gran problema de salud pública que afecta tanto a animales como personas, elevando no sólo el gasto sanitario sino también aumentando la mortalidad en infecciones graves debida a un grupo numeroso de bacterias. Ante esta situación es necesaria la búsqueda de alternativas eficaces y económicamente viables para combatir de microorganismos de una forma eficiente. La presente Tesis Doctoral, compuesta de tres partes, muestra por un lado, el estudio de la prevalencia de las resistencias de un patógeno concreto y la aplicación de un modelo matemático que permite la posibilidad de aplicar un tratamiento empírico con una probabilidad de éxito por encima del 90%. Así, la implementación de este tipo de herramientas, que permiten predecir y prever el comportamiento epidemiológico de estos patógenos y que por ende, permiten establecer medidas eficaces para su prevención, diagnóstico y tratamiento, son claves para establecer un diagnóstico certero. En este caso concreto, la modelización matemática, basada en el uso de programas informáticos en los que se implementa computacionalmente un modelo matemático permite simular el comportamiento de una epidemia, en el sentido en el que permite el seguimiento del estado de poblaciones sanas, infectadas, curadas y que no han superado la enfermedad. Asimismo, este mismo modelo se está aplicando en la actualidad a muchas enfermedades infecciosas de carácter bacteriano o vírico, como el SARS-COVID 19, proporcionando una información predictiva muy valiosa para su control. En el campo de la Medicina Veterinaria Clínica no tenemos constancia de que se haya implementado nunca antes un modelo de estas características, por lo que esta investigación puede abrir un camino que ofrece grandes posibilidades y que tendrían una repercusión directa sobre la salud animal y por ende, la salud pública. Por otro lado, centrándonos en la búsqueda de nuevos potenciales tratamientos farmacológicos alternativos a la antibioterapia convencional para infecciones por microorganismos del tipo Gram positivos S. pseudintermedius y S. aureus y para Gram negativos, por E. coli y P. aeruginosa, que son patógenos muy relevantes en infecciones multirresistentes. Con referencia a los patógenos Gram positivos hemos estudiado la acción antimicrobiana y frente a la formación del biofilm, un importante factor de virulencia clave en el desarrollo de resistencias antimicrobianas, de diferentes azocompuestos. Estos compuestos se utilizan ampliamente en la industria como tintes sintéticos y se aplican como colorantes para pinturas, textiles, industria alimentaria o cosmética. También se ha extendido su uso en otros campos, entre los que destacamos la biomedicina, como indicadores en sensores que utilizan materiales funcionales con fluorescencia u optoelectrónica. Asimismo, los compuestos con funciones azo pueden unirse a numerosos metales, formando complejos que muestran propiedades antifúngicas y antibacterianas. A pesar de la abundante literatura acerca de las propiedades antimicrobianas de estos azocompuestos, su efecto sobre la formación del biofilm, un importante factor de virulencia, por parte de las bacterias patógenas así como de los mecanismos de acción exactos de toxicidad no han sido estudiados en profundidad. En el presente trabajo de investigación hemos podido comprobar que los compuestos con funciones azo ensayados poseen una notoria acción antimicrobiana frente a las cepas de S. pseudintermedius y S. aureus, permitiéndonos dilucidar su mecanismo de acción, así como su acción frente a la formación del biofilm. Todo ello nos ha permitido diseñar una potencial aplicación terapéutica tópica que consideramos de gran utilidad. Finalmente, como estudio complementario centrado en las cepas Gram negativas E. coli y P. aeruginosa hemos podido determinar que ciertos carbenos heterocíclicos metálicos de plata, así como compuestos tipo carboxilatos de nueva síntesis de este mismo metal son muy efectivos frente a estos patógenos. Aunque, numerosos estudios muestran que tanto determinados complejos metal-carbeno como los dicarboxilatos poseen propiedades antimicrobianas, sin embargo, sus mecanismos concretos de acción no habían sido previamente estudiados. Al igual que para los azocompuestos, hemos podido determinar su mecanismo de acción y su acción frente al biofilm. Asimismo, hemos podido determinar una relación estructural-funcional muy significativa en el campo de la terapéutica que abre futuras y prometedoras nuevas líneas de investigación.
Aplicación de técnicas microbiológicas y químicas para la recuperación de suelos contaminados por plaguicidas e hidrocarburos aromáticos policíclicos. Evaluación de su viabilidad mediante estudios de biología molecular y ecotoxicidad
(2021-04-27) Lara Moreno, Alba; Merchán Ignacio, Francisco; Villaverde Capellán, Jaime; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
En la actualidad existe un interés creciente por los métodos de recuperación biológicos de suelos contaminados, presentándose la biorrecuperación como una alternativa a los métodos convencionales (landfilling, incineración o descomposición química). Se trata de una herramienta respetuosa con el medio ambiente, de bajo coste y no invasiva, que utiliza organismos vivos para detoxificar las sustancias de riesgo para el hombre y el medio ambiente. Por este motivo, en este estudio para conseguir la recuperación de suelos contaminados se han llevado a cabo ensayos de biodegradación y mineralización en medio acuoso, en suspensiones suelo-agua y en suelo. Los contaminantes orgánicos estudiados en este trabajo fueron: cinco herbicidas pertenecientes a la familia química de las fenilureas (diurón, linurón, isoproturón, clortolurón y fluometurón), otro herbicida de la familia de las dinitroanilinas (trifluralina), un insecticida organofosforado (clorpirifós), así como hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) de bajo y alto peso molecular. Cuando la biodegradación no se puede llevar a cabo de forma natural debido a que los microorganismos no disponen de los nutrientes esenciales para ello en la zona contaminada, o no presentan las herramientas metabólicas necesarias para actuar sobre un determinado contaminante, se requiere de la intervención mediante actuaciones encaminadas a fomentar la actividad microbiológica, siendo necesario recurrir a la biodegradación asistida a través del empleo de dos posibles técnicas: bioestímulo (mediante la adición de nutrientes) y bioaumento (inoculando microorganismos de origen endógeno y/o exógeno). Los macro y micronutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano suelen estar presentes en el suelo en cantidades demasiado bajas, provocando una limitación para la actividad microbiana, de ahí la necesidad de emplear una solución de nutrientes que actúe como estimulante de los microorganismos degradadores presentes en el suelo. Los microrganismos usados como degradadores específicos se obtienen mediante cultivos de enriquecimiento de suelos que han estado en contacto con el contaminante durante un largo periodo de tiempo. La microbiota del suelo se expone a una elevada concentración de contaminante, facilitando de esta forma el crecimiento de aquellos microorganismos que presentan la capacidad de usar como fuente de carbono y energía al contaminante orgánico en cuestión. Los procesos de recuperación de suelos contaminados por compuestos orgánicos como plaguicidas y PAHs están a menudo muy limitados a consecuencia de sus propiedades físicoquímicas, baja solubilidad, elevado kow y koc, estructura aromática, grupos halogenados, etc. Estas propiedades hacen que la fracción biodisponible del contaminante en el suelo sea muy baja y, por lo tanto, sean sustancias recalcitrantes mostrando una elevada persistencia. Con el fin de mejorarla, en el presente estudio se han empleado ciclodextrinas, oligosacáridos cíclicos que, gracias a su capacidad para formar complejos de inclusión con compuestos orgánicos hidrofóbicos, son capaces de incrementar su solubilidad en agua y en consecuencia su biodisponibilidad. El descenso de la concentración inicial del contaminante no implica la no formación y acumulación de metabolitos tóxicos, lo que haría replantear la aplicación o no de una determinada técnica de biorrecuperación. Por lo que, ensayos de ecotoxicidad han sido realizados al inicio y al final de los tratamientos aplicados en el presente trabajo, mediante la monitorización de la bioluminiscencia natural de la bacteria Vibrio fisheri (Microtox®), con el fin de evaluar la eficacia y seguridad de la estrategia de descontaminación empleada y por lo tanto su viabilidad. Los estudios de biología molecular llevados a cabo han ayudado igualmente, a evaluar la viabilidad de las técnicas de biorrecuperación empleadas. Gracias al empleo de distintas técnicas de biología molecular se ha conseguido, por un lado, identificar las cepas bacterianas aisladas y seleccionadas como degradadoras de los distintos contaminantes orgánicos estudiados mediante la secuenciación del ARN ribosómico 16S, y por otro lado, secuenciar el genoma de la cepa bacteriana seleccionada y describir la ruta de degradación de fenantreno que utiliza, gracias a la identificación de los metabolitos formados y de los genes que codifican las enzimas responsables de llevar a cabo la ruta de degradación, mediante una amplia búsqueda bibliográfica y un análisis exhaustivo de la anotación del genoma bacteriano empleando diversas bases de datos. Para la confirmación de la presencia de estos genes degradadores en el genoma bacteriano, se emplearon herramientas bioinformáticas (BLAST, Clustal Omega, etc.) que nos permitieron alinear la secuencia del gen con el genoma de la cepa bacteriana estudiada (Stenotrophomonas maltophilia CPHE1), confirmando la posibilidad de la presencia de dicho gen en la bacteria de estudio. Por último, una vez identificados los genes implicados, se estudió su expresión empleando la Reacción en Cadena de la Polimerasa Reversa (RT-PCR), confirmando así la posible ruta de degradación propuesta.
Nuevas estrategias para el control de la enfermedad celíaca: caracterización de los péptidos imunogénicos del gluten y validación clínica de un biomarcador para el seguimiento del paciente celíaco
(2021-03-19) Ruiz Carnicer, Ángela; Sousa Martín, Carolina; Comino Montilla, Isabel María; Moreno Amador, María de Lourdes; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
La enfermedad celiaca (EC) se define como una enteropatía inflamatoria crónica del intestino delgado causada por la ingesta de gluten en individuos genéticamente predispuestos. El término gluten hace referencia a las proteínas responsables de la cohesividad, viscosidad y elasticidad de la masa del trigo, la cebada, el centeno, la avena, y sus derivados. El gluten es una mezcla de dos grupos de proteínas las prolaminas (denominadas gliadinas en el trigo, hordeínas en la cebada, secalinas en el centeno y aveninas en la avena) y las glutelinas (gluteninas para el trigo, y sus homólogas para cebada, centeno y avena). Dichas proteínas son resistentes a las enzimas digestivas y, por lo tanto, posterior a la ingestión de alimentos que contienen gluten, se generan péptidos inmunogénicos capaces de producir daño en la mucosa intestinal de los pacientes celíacos. Esta lesión se caracteriza, histológicamente, por un infiltrado de linfocitos a nivel intraepitelial y una hiperplasia de criptas con distintos grados de atrofia de las vellosidades intestinales. Clínicamente la EC presenta una gran variedad de síntomas, tanto gastrointestinales como extra-intestinales. Los síntomas clásicos incluyen diarrea crónica, esteatorrea, distensión abdominal, dolor, pérdida de peso y anemia. En niños además es común que presenten retraso en el crecimiento y baja estatura. Sin embargo, existen situaciones en las que las manifestaciones digestivas están ausentes u ocupan un segundo lugar. Estas formas atípicas incluyen manifestaciones que pueden ser orales, cutáneas, cardíaca, dermatológicas, neurológicas, articulares, hepáticas, endocrinas, ginecológicas, psiquiátricas y hematológicas. También es frecuente que aparezcan otras complicaciones graves como adenocarcinomas intestinales. En la actualidad, el único tratamiento disponible para los celíacos es el seguimiento de dieta sin gluten (DSG). Se ha demostrado que una estricta adherencia a la DSG es fundamental para eliminar los síntomas de la enfermedad, evitar deficiencias nutricionales y mejorar la calidad de vida de los enfermos celíacos evitando complicaciones a corto-medio plazo de gran morbilidad y coste socio-sanitario (osteopenia-osteoporosis, enfermedades autoinmunes, desnutriciones intrauterinas, etc.). No obstante, numerosos estudios han sugerido que las transgresiones de la dieta tanto deliberadas como involuntarias son relativamente frecuentes. Entre las principales causas del incumplimiento se encuentran los condicionamientos de la vida social, el elevado coste de los productos dietéticos especiales o las dificultades tecnológicas para garantizar la ausencia de gluten en los alimentos complejos. La cantidad de gluten capaz de causar daño en la salud del celíaco es muy baja se ha descrito que el límite es inferior de 10 mg por día. Por lo tanto, es imposible evaluar la suma de todas las contaminaciones diarias individuales para saber si el celíaco ha excedido este umbral. Así pues, mientras que algunos pacientes logran una recuperación total de su enfermedad mediante el seguimiento de una DSG; hay celíacos que requieren un control periódico para conocer la eficacia del tratamiento; y otros muchos que darían la bienvenida a nuevos productos alimenticios que permitan una mayor flexibilidad en su dieta. En base a ello, el trabajo realizado en esta Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio de nuevas estrategias de control de la enfermedad celíaca, por un lado, mediante la caracterización de péptidos y epítopos inmunogénicos del gluten en distintas variedades de trigos comerciales; y por el otro, mediante la validación clínica de un biomarcador para el seguimiento de la dieta del paciente celíaco. El Capítulo 1 es una introducción general sobre la enfermedad celíaca. En el Capítulo 2 se exponen los antecedentes del tema y los objetivos principales de esta Tesis Doctoral. El Capítulo 3 comprende una revisión bibliográfica global sobre las patologías relacionadas con la ingesta de gluten, que son un grupo de desórdenes inmunológicos que se clasifican según los síntomas clínicos que producen y la respuesta inmune generada. La elevada prevalencia de estas enfermedades y los efectos nocivos de las proteínas del gluten para la salud representan un reto clínico y científico importante. En el capítulo 4, se caracterizan variantes de epítopos inmunogénicos del gluten en las α-gliadinas de la tribu Triticeae, tanto en especies diploides, como tetraploides y hexaploides de trigo. Estas gliadinas representan la fracción con mayor inmunogenicidad del gluten. Por ello, el estudio de la capacidad inmunoestimuladora de variantes de epítopos canónicos con sustituciones de aminoácidos, de manera que se elimine la toxicidad de estos epítopos, ofrece nuevas posibilidades en la generación de trigos con una toxicidad reducida. Dichas variedades ayudarían a minimizar la presencia de epítopos inmunogénicos en la harina de trigo, manteniendo las propiedades nutricionales y tecnológicas de este cereal. En el Capítulo 5 se ha llevado a cabo un ensayo clínico prospectivo con pacientes celíacos, que llevan más dos años a DSG, en el que se ha determinado la utilidad clínica de los péptidos inmunogénicos del gluten (GIP) en orina como nuevo biomarcador para controlar la adherencia a la DSG correlacionándolo con parámetros clínicos e histológicos característicos de la enfermedad. Mediante este estudio, se ha demostrado que la ausencia repetida de GIP en orina permite verificar el correcto cumplimiento de la DSG a la vista de su relación con la ausencia de atrofia vellositaria, evitando la necesidad del uso de técnicas más invasivas para estudiar las posibles lesiones histológicas en el intestino del enfermo celíaco. En el Capítulo 6, se discuten los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral, abordando su aplicación para el control y seguimiento de la DSG. Por último, en el Capítulo 7, se incluyen las conclusiones alcanzadas en esta Tesis Doctoral.
Etiología, distribución y costos de las diarreas infantiles
(1988-11-28) Márquez Calderón, Soledad; Perea, Evelio J; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
Realizamos un estudio de cohortes con objeto de conocer la incidencia de diarreas en la población infantil y la frecuencia de posibles factores de riesgo (portadores asintomáticos, nivel socioeconómico, peso e indicadores de salud). Para ello, seguimos prospectivamente durante un año a un grupo de 144 niños entre 0 y 3 años de edad nacidos y residentes en Sevilla, a los cuales elegimos al azar del registro civil de la ciudad. A cada niño les tomamos 2 muestras de heces para estudio de portadores sanos de microorganismos enteropatógenos; una al comienzo del trabajo y otra a lo largo del año de seguimiento. Encontramos las siguientes tasas de prevalencia: 7% de portadores de escherichia coli enteropatógeno (ecep), 4% de giardia lamblia y 14% de rotavirus. El estado de portador asintomático de ecep fue más frecuente en niños de nivel socioeconómico alto y el de giardia lamblia en niños con peso alterado y en los no vacunados. La incidencia de diarrea fue de 47 episodios por cada 100 niños al año. Fue más frecuente en los niños de nivel socioeconómico bajo. La causa más frecuente de diarrea fue rotavirus (24%), seguido de ecep (9%), salmonela spp (6%) y campylobacter jejuni (6%). Por cada 100 casos de diarrea infantil se afectan 65 familiares, se realizan 74 consultas médicas y 12 ingresos hospitalarios. La pauta más frecuente de tratamiento (51%) fue hacer dicta y tomar medicamentos. Por cada 100 diarreas se prescriben 42 antidiarreicos y 35 antimicrobianos, y se gastan 14.800 pesetas o más en medicamentos. Cada 100 diarreas conllevan además 17 días de absentismo laboral de los padres.
Caracterización epidemiológica y clínica de la infección y colonización por Escherichia coli perteneciente al complejo clonal O25b/ST131
(2020-10-20) Morales Barroso, Isabel; Rodríguez-Baño, Jesús; Pascual Hernández, Álvaro; Universidad de Sevilla. Departamento de Medicina; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
Introducción. Escherichia coli secuenciotipo 131 (ST131) es un clon que combina capacidad de propagación exitosa, resistencia a los antibióticos y virulencia; de hecho, los aislamientos de ST131 generalmente exhiben los factores de virulencia asociados característicos de las cepas de E. coli patógenas extraintestinales (ExPEC). Este clon se ha diseminado rápidamente por todo el mundo en las últimas décadas, contribuyendo de forma importante al aumento de la prevalencia de resistencia a los antimicrobianos en E. coli. Sin embargo, la información sobre la epidemiología e impacto clínico de E. coli ST131 es limitada. La mayoría de los estudios epidemiológicos sobre colonización intestinal o infecciones causadas por ST131 se han realizado en aislamientos que producen β-lactamasas de espectro extendido (BLEE); sin embargo, la mayoría de los aislados de ST131 no producen estas β-lactamasas. Lo mismo ocurre con el impacto clínico de las infecciones. Esto se debe a que los aislados de ST131 carecen de un marcador fenotípico específico, por lo que deben aplicarse métodos moleculares a una gran cantidad de aislamientos de E. coli para identificar a los que pertenecen al grupo clonal ST131. Objetivos. (1) Describir la prevalencia de colonización intestinal por E. coli ST131 (productor y no productor de BLEE) en convivientes y contactos hospitalarios en pacientes con infección por este microorganismo. (2) Identificar los factores de riesgo asociado a la colonización intestinal por E. coli ST131 (productor y no productor de BLEE) en convenientes y contactos hospitalarios de pacientes con infección por estos microorganismos. (3) Identificar los factores de riesgo para la bacteriemia por E. coli ST131 no productor de BLEE. (4) Evaluar el impacto pronóstico de los aislados de E. coli ST131 no productor de BLEE causantes de la bacteriemia. Metodología. Los objetivos 1 y 2 se estudiaron mediante estudio de cohortes en 34 grupos (clusters) de convivientes comunitarios y 30 de contactos hospitalarios de otros tantos casos índice (pacientes que habían sufrido una infección por E. coli ST131). La colonización rectal por ST131 E. coli se estudió en todos los participantes mediante la realización de hisopos rectales en la primera semana tras la detección del caso índice, y 1 y 3 meses después. Los factores de riesgo para la bacteriemia por E. coli ST131 se realizó un estudio de casos y controles; los casos fueron los pacientes con bacteriemia por estos microorganismos; los dos siguientes pacientes con bacteriemia por E. coli no-ST131 del mismo centro fueron elegidos como controles si ocurrieron en menos de un mes del caso correspondiente. Finalmente, el impacto pronóstico de la bacteriemia por ST131 se estudió en la cohorte de pacientes con bacteriemia por ST131 y no-ST131. Los pacientes de ambos estudios fueron prospectivamente incluidos tras estudiar en tiempo real los aislados de E. coli mediante PCR para O25b rfb y el alelo 3 del gen pabB, y multiplex PCR para filogrupo B23. Los estudios se realizaron en dos hospitales de tercer nivel que asisten a 1.100.00 habitantes entre enero de 2010 y octubre de 2012 en la provincia de Sevilla. Resultados. Se detectó colonización por E. coli ST131 en algún momento en 18/64 (28,1%) de los convivientes de casos índice comunitarios, lo que ocurrió en 13/34 (28,2%) de los conglomerados (clusters) domiciliarios; y en 8/54 (14.8%) contactos de casos nosocomiales, lo que ocurrió en 8/30 (26.6%) conglomerados (clusters) nosocomiales. Las variables asociadas con la colonización por ST131 en los contactos comunitarios en el análisis ajustado multinivel fueron el uso de inhibidos de la bomba de protones en el nivel individual (OR ajustada: 3,08; intervalo de confianza [IC] al 95%: 0,88-10,80; p=0,07) y la edad del paciente índice en el nivel de clusters (OR ajustada: 1,05 por año; IC 95% 1,01-1,10; p=0,05). En los casos nosocomiales, solo se precisó realizar el análisis multivariante con las variables del nivel individual, siendo el ser dependientes para las actividades básicas (OR ajustada: 21,1; IC 95%: 3,62-160,0; p=0,001) y ser portador de catéter urinario (OR ajustada: 8,4; IC 95%: 0,97-76,9; p=0.05) las asociadas a mayor riesgo de colonización. En cuanto a las bacteriemias, sólo la cirugía reciente (OR = 7.03, IC 95% 1.71–28.84; P = 0.007) y el origen desconocido de la bacteriemia (OR = 5.37, IC 95% 0.93–30.81; P = 0.05) se asociaron con mayor riesgo de ST131. El que el aislado fuera ST131 no se asoció con la mortalidad (OR ajustada: 0,53; IC 95% 0,18-1,57; p=0,26), fracaso clínico en el día 14 (OR ajustada: 0,60; IC 95%: 0,15-2,33; p=0.46) o presentación en forma de sepsis grave o shock séptico (OR ajustada: 0,81; CI 95%: 0,30-2,15; p=0,67). Conclusiones. La prevalencia de colonización intestinal por E. coli ST131 (productor y no productor de BLEE) fue mayor en convivientes que en contactos hospitalarios. Se han identificado factores asociados a mayor riesgo de colonización intestinal en convivientes y contactos nosocomiales, así como a mayor riesgo de bacteriemia por E. coli ST131 no productor de BLEE. Finalmente, la bacteriemia por E. coli ST131 no productor de BLEE no se asoció con mayor gravedad o mortalidad respecto a otros clones de E. coli.
Análisis de comunidades microbianas presentes en la cueva de Doña Trinidad (Ardales, Málaga) utilizando cultivos y métodos moleculares basados en ADN y ARN
(2008-10-06) Stomeo, Francesca; González Grau, Juan Miguel; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
Microorganisms constitute an extremely heterogeneous group of organisms on our planet and microbial communities generally show an extraordinary potential of metabolic capacities (Brock and Madigan, 2000). However, only a small number of microorganisms are known and have been properly described, since only an extremely low portion of microorganisms can be cultivated through traditional microbiological techniques (Curtis et al., 2002). Thanks to the development of new molecular methods it is now possible to identify previously undetected microorganisms considered uncultivable in the laboratory. Historical Cultural Heritage sites often offer an adequate scenario for the growth of microorganisms, which can thus cause damage, sometimes irreversible, to the artistic representations. In particular, underground environments such as caves and catacombs, in which the temperature is relatively constant throughout the year and the humidity generally high, offer a favourable habitat for the growth of numerous microorganisms (Agarossi, 1992). The present study is part of a multidisciplinary project focused on the conservation of the works of art of Ardales’s Cave and represents the first microbiological study in this cave. The Cave of Doña Trinidad is located in the town of Ardales, Malaga (Spain). The cave has a length of 1.5 km with several halls and galleries. The interior contains labyrinths of columns, underground lakes, and beautiful formations of stalactites and stalagmites. The cave contains paintings and engravings dating back to about 20,000 years, belonging to the Upper Paleolithic. The samples analyzed were collected from the cave’s soil and from the main artistic representations (engraving of a fish, serpents, red pigments and black tracks from the cave). In particular, the microbial composition of white colonizations present in the cave was studied. In recent years, those colonizations have spread abundantly throughout the cave. Results showed a dominance of Proteobacteria in the studied samples except in white colonizations. Among the metabolically active communities of the cave, Gammaproteobacteria and Alphaproteobacteria were the most abundant in soil samples, engravings, red pigments and black tracks. Firmicutes, Bacteroidetes, Deinococci, Chloroflexi, Planctomycetes and Nitrospirae were present at lower proportions (as revealed by DNA-based molecular methods) while Acidobacteria and Sulphate reducing bacteria showed high diversity. The analysis of the bacterial communities of the white colonizations showed significant differences with respect to the other studied samples. The Actinobacteria phylum and in particular the genus Pseudonocardia, was the most metabolically active component of these colonizations as a result of DNA and RNA libraries. Molecular fingerprints of the metabolically active microbial communities also showed a major, almost exclusive, band corresponding to sequences belonging to the genus Pseudonocardia showing that Pseudonocardia played a key role in white colonizations’ expansion in Ardales’s Cave (Stomeo et. al., 2007). Considering these results and the important role played by Pseudonocardia in the cave, we tried to cultivate this bacterium in the laboratory. We obtained three strains of this genus and they were used to carry out enzymatic and metabolic studies. To investigate the metabolism of Pseudonocardia and the best conditions for its growth we carried out colonization’s experiments (in the laboratory) with the isolated strains using cave’s soil as substrate, with and without the addition of different nutrients (carbon, nitrogen and phosphate), at 16 ºC (cave’s temperature) and at 28ºC. The results indicated that Pseudonocardia grows better in the presence of glucose and phosphate with a significant statistical value (P<0.05) with respect to others nutrients showing that this bacterium’s proliferation is maintained by the cave’s temperature and its development is favoured by organic nutrients and phosphate’s sources which might being limiting Pseudonocardia’s growth in situ. Rarefaction curves of bacterial phyla detected in this study through molecular methods indicated that, even if a higher number of clones were analyzed it would not have been possible to detect additional bacterial phyla; the OTUs curves suggested the presence of an elevated bacterial diversity in the cave under study. In the case of isolated strains, OTUs rarefaction curves indicated that, culture techniques only allowed the detection of a reduced fraction of microorganisms in the cave because an asymptote was reached well below the curve obtained by culture-independent methods based on DNA, cloning and sequencing. With regard to the fungal diversity in Ardales’ Cave, the results indicated the presence of Ascomycota and Basidiomycota. The most frequent orders in the cave were Hypocreales and Eurotiales (Ascomycota) and Tremellales among Basidiomycota. Fusarium (Hypocreales) was the unique fungal genus detected through DNA libraries. This suggested its high presence in the cave and that its spread by spores’ production could seriously deteriorate Ardales’ Cave paintings and engravings. As for Pseudonocardia, this fungus was isolated in the laboratory and colonization assays were performed. The results obtained indicated that this fungus’s growth is favored at 28 °C and in the presence of nitrogen sources (p <0.05). Rarefaction curves showed that during this study, it was possible to detect an extremely significant portion of fungal species present in the cave of Doña Trinidad. Results obtained during this study have led to the following general conclusions: - Proteobacteria represented the most characteristic phylum in the analyzed samples with the exception of white colonizations. Gammaproteobacteria and Alphaproteobacteria represented the main classes showing metabolic activity in the studied samples. - Other bacterial phyla revealed during this study are: Acidobacteria, Sulphate reducing Bacteria, Chloroflexi, Planctomycetes, Deinococci, Nitrospirae and Bacteroidetes. The role these phyla play in the cave is unknown, since their metabolism and physiology are not yet well understood. - White colonizations present in the cave were composed mainly by Actinobacteria, in particular by the genus Pseudonocardia. - The presence of fungal species was detected in the Cave of Doña Trinidad. Among these, the orders Hypocreales, Eurotiales (Ascomycota) and Tremellales (Basidiomycota). Fusarium (Hypocreales) was the most abundant fungal genus detected in the cave during this study. - Molecular methods based on DNA were useful to identify the bacterial and fungal members of the microbial communities in the studied cave. Molecular techniques based on RNA allowed the identification of those bacteria metabolically active in the analyzed communities. - The combination of standard culture techniques and molecular methods is essential for fungal classification. - Through this study it was possible to determine the majority of bacterial and fungal components of the microbial communities of Doña Trinidad Cave. Among these, Pseudonocardia (Bacteria) and Fusarium (Fungi) represented the major risks for the cave’s conservation. - The cultivation of bacteria and fungi allowed the study of the strains’ capability to grow under different conditions. - In order to reduce the proliferation of Pseudonocardia throughout the cave, it would be necessary to limit the amount of organic material and phosphate in the cave. - With regard to Fusarium, it would be necessary to maintain stable the temperature in the cave and limit nitrogen’s sources, in order to reduce the possibility of proliferation of this fungal species.
Redes de señalización implicadas en la regulación del metabolismo de las ectoínas en la bacteria halófila Chromohalobacter salexigens y su potencial terapéutico como agente neuroprotector
(2020-07-21) García Valero, Rosa María; Argandoña Bertrán, Montserrat; Vargas Macías, Carmen; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología
Chromohalobacter salexigens is a halophilic bacterium which naturally produces ectoine and hydroxyectoine, two biotechnologically important compatible solutes that are accumulated in response to osmotic and heat stress, respectively. The exploitation of C. salexigens in biotechnology as a producer of ectoines requires an integral understanding of the regulatory pathways controlling ectoines metabolism. The availability of its genomic sequence, physiological, biochemical, genetic, and high performance transcriptomics data, previously obtained from our Research Group, together with regulatory studies (this work), will allow us to obtain a more global knowledge of the metabolism of the ectoines in C. salexigens. The aim of this PhD was two-fold. On the one hand, to gain insight on the regulatory circuits controlling the metabolism of ectoines in C. salexigens. On the other, to progress in the biomedical use of ectoine for the prevention and treatment of neurodegenerative diseases. The findings presented in this work provide clues for a better understanding of the complex regulation of ectoine metabolism and osmoadaptation in this moderately halophilic bacterium, and its contribution to adaptation to extreme environments. Our results will be overlayed on the existing high-quality genome-based metabolic model and global analyzes, in order to facilitate the rational design of new strains for Systems metabolic engineering. Additionally, we have investigated the in vitro and in vivo application of ectoine as neuroprotective- and inflammation-preventive- treatment in an Aβ murine model of Alzheimer's disease. Thus, we have got more insight in its potential applications in biomedicine, especially in neurodegenerative disorders as Alzheimer’s disease (AD). EupR is the first-described response regulator of a two-component system involved in bacterial osmoregulation (Rodríguez-Moya et al., 2010). Through in silico studies, EupK was selected as its putative cognate histidine kinase. Phenotypic analyses of eupR and eupK mutants showed that both, EupR and EupK, participate in the control of the three processes within the metabolism of ectoines, synthesis, degradation/recycling and uptake, as a key system that allows the fine adjustment of the intracellular concentration of these solutes. Nevertheless, the association between EupK and EupR could not be confirmed by these analyses, as eupK did not always reproduce the eupR phenotype. This finding pointed out to the involvement of additional HKs and/or RR that would participate in the control of ectoines metabolism. Additional in vivo protein-protein interaction and phosphotransfer experiments, demonstrated not only the interaction between EupK and EupR, but also the functionality of the two component system, as EupK was able to phosphorylate EupR. As EupK is a hybrid HK that lacks the HPt domain involved in phosphotransfer during phosphorelay events, three hybrid HKs, Csal_1062, Csal_1635 and Csal_2667, were selected as the most suitable candidates to form part of the EupK/EupR signalling network by providing this phosphotransfer domain. Our results indicate that EupK and EupR constitute a two-component system, which form part of a "many to one"-type complex signaling network with the other hybrid HKs, where EupR is phosphorylated by all of them. These cross-talk events within the response regulator could be developed either by a direct phosphorylation of the REC domain of EupR by the HisKA domains of the hybrid histidine kinases, or through a phosphorelay mechanism involving additional HPt domains, and could depend on the environmental conditions. Besides, this branched and/or crossed regulation circuit would be able to detect and respond to both salinity and extracellular ectoine stimuli. Furthermore, transcriptomic experiments revealed that the elimination of eupR affected more than 18 and 22% of C. salexigens genes at low and high salinity respectively, distributed throughout the different functional categories described by COG. This result suggested that EupR has a global impact on C. salexigens physiology. Among them, 20 transcriptional regulators were differentially expressed in the mutant, strongly suggesting that EupR is a regulator of regulators, and explaining the large number of genes affected by its deletion. The importance of this regulator should be highlighted in the so-called "nitrogen channeling" that occurs in C. salexigens (Pastor et al., 2013), by controlling the balance between protein synthesis, nitrogen metabolism and ectoine synthesis, possibly through the global nitrogen regulator NtrC, among others. Another of the processes controlled by this regulator would be chemotaxis, which should be directly related to osmodetection in C. salexigens, as flagellum motility is Na+-dependent (Salvador et al., 2018). This regulatory mechanism might be exerted through the control of other two-component systems such as CheA and CheY. On the other hand, the implication of EupR in central metabolism was remarkable, with 212 and 306 genes differentially expressed at low and high salinity, respectively. Among them, we should highlight those involved in carbon metabolism, by influencing the different metabolic flows distribution balance: (i) glucose assimilation by regulating the Entner-Doudoroff (ED) periplasmic and cytoplasmic route; (ii) nitrogen metabolism and (iii) the energetic metabolism through the control of oxidative phosphorylation, especially at high salinity. Finally, the results revealed a strong influence of EupR on C. salexigens osmoadaptation, where EupR could have a role in regulating the hierarchical accumulation of compatible solutes, in order to ensure the appropriate intracellular concentration of the different solutes according to the environmental constraints, the carbon source, or the presence of osmoprotectants in the external medium, among others. A final conclusion is that EupR would meet all the criteria to be postulated as a global regulator involved in the control of the metabolism of compatible solutes, especially that of ectoines, as well as the energy producing processes and central metabolism of C. salexigens. Hence, it would influence the C. salexigens metabolic and physiological adaptations to the external osmolarity. The results arising from this work will contribute to elucidate the complex regulatory network involved in the control of ectoine synthesis, which in turn will allow the construction of a signaling and transcriptional regulatory model for C. salexigens. On the other hand, the in vitro and in vivo neuroprotective capacity of ectoine was evaluated in this work. Our results demonstrate the ectoine’s protective capacity against the oxidative damage, its antioxidant activity in human neuronal cells, as well as its capacity to prevent the formation of ADDL oligomers responsible for inflammation. In addition, ectoine was able to cross the blood-brain barrier and reach cerebral areas where Alzheimer diseased is developed, as cortex or hippocampus, and to remain with pharmacologically active concentrations during 48h. Intragastric administration of ectoine during 3 months in young transgenic APP/PS1 mice (which develop AD), improved their memory and diminished Aβ concentration in brain tissue. A decrease in plaques size accompanied by an increased recruitment of the microglia was also observed. Additionally, ectoine intragastric inoculation led to similar concentrations in brains that those achieved upon intraperitoneal administration, within the range of activity observed in vitro, suggesting that oral administration of ectoine would be feasible. All these results pointed to ectoine as an interesting candidate to be used as a drug for the prevention and treatment of neurodegenerative diseases.
Epidemiología de la leishmaniosis en la provincia de Sevilla
(2006-05-31) Reina Mulero, Francisco; Úbeda Ontiveros, José Manuel; Ariza Astolfi, Concepción; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología y Parasitología

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