Tesis (Microbiología)

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Farmacocinética y farmacodinamia de piperacilina/tazobactam y fosfomicina en pacientes con bacteriemia por enterobacteriaceae
(2024-05-02) Merino Bohórquez, Vicente; Pascual Hernández, Álvaro; Rodríguez-Baño, Jesús; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología; Universidad de Sevilla. Departamento de Farmacología; Universidad de Sevilla. Departamento de Medicina
En esta tesis se aborda el estudio de la farmacocinética y farmacodinamia de dos antimicrobianos en bacteriemias por enterobacterias. Por un lado, piperacilina-tazobactam (PTZ), donde se analiza la variabilidad farmacocinética de este antimicrobiano en pacientes no críticos con bacteriemias por enterobacterias (BE) y donde se explora los resultados clínicos previstos y la neurotoxicidad relacionada con la piperacilina en diferentes situaciones relacionadas con la función renal de los pacientes. Se incluyeron pacientes hospitalizados, no críticos, tratados con piperacilina-tazobactam para BE. Se recogieron y analizaron cuatro muestras de suero por paciente y posteriormente, se desarrolló un modelo farmacocinético poblacional utilizando el paquete Pmetrics? (software R) para realizar simulaciones de Monte Carlo de varios regímenes de dosificación de PTZ: 4 g de piperacilina, administrados cada 8 h o cada 12 h mediante infusión corta (0,5 h) o larga (4 h), ajustadas a las diferentes filtraciones glomerulares (TFG) según las categorías utilizadas para clasificar la enfermedad renal crónica (Kidney Disease: Improving Global Outcomes, KDIGO). Para ello, se calculó la probabilidad de alcanzar el objetivo (PTA) utilizando concentraciones de fármaco libre por encima de la concentración inhibitoria mínima (fT>CMI) del 5% para eficacia y los objetivos para la neuro y nefrotoxicidad asociada a piperacilina. Se incluyeron 27 pacientes (102 muestras), donde las infusiones prolongadas de piperacilina alcanzaron un PTA>90% (50%fT>CMI) dentro del rango de sensibilidad, aunque una dosis de carga no mejoró en gran medida el resultado esperado. Por otro lado, las infusiones prolongadas redujeron la toxicidad esperada en pacientes con insuficiencia renal grave y el estudio respalda el uso de infusiones prolongadas de PTZ en pacientes no críticos con EB. El otro antimicrobiano estudiado es la fosfomicina y en este estudio describimos la farmacocinética poblacional de fosfomicina en pacientes con infección bacteriémica de origen urinario (IBTU). El análisis realizado identificó regímenes óptimos sobre la base de objetivos farmacodinámicos y evaluó la idoneidad de los puntos de corte de susceptibilidad para Escherichia coli del Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI) y del Comité Europeo sobre Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST). Para ello, se analizaron los datos de 16 pacientes con IBTU causada por E. coli multirresistente (ensayo clínico FOREST) que recibieron fosfomicina intravenosa (4 g cada 6 horas). Se realizó un análisis farmacocinético poblacional y se realizaron simulaciones de Monte Carlo utilizando 4 g cada 6 horas y 8 g cada 8 horas. La probabilidad de alcanzar el objetivo farmacodinámico se evaluó utilizando objetivos farmacodinámicos para E. coli para el efecto estático, la caída de 1 log en la carga bacteriana y la supresión de la resistencia. El análisis de consecución del objetivo farmacodinámico mostró una leve mejoría al aumentar la dosis de fosfomicina (4 g cada 6 horas frente a cada 8 horas), demostrándose el éxito para disminuir la carga bacteriana de 1 log en 89 % a 96 % (puntos de corte EUCAST) y 33 % a 54 % (puntos de corte CLSI) de los pacientes, sin embargo, no pudieron alcanzar los objetivos de supresión de la resistencia bacteriana. Las concentraciones de fosfomicina son muy variables, hecho que se explica parcialmente por la insuficiencia renal. Por tanto, el presente trabajo respalda el uso de 4 g cada 6 horas como un régimen eficaz para el tratamiento de pacientes no críticos con IBTU causada por E. coli multirresistente, ya que dosis más altas podrían aumentar la toxicidad pero no aumentar significativamente la eficacia.
Mecanismos moleculares y fisiológicos que participan en el diálogo simbiótico de Rhizobium tropici CIAT 899 y sus leguminosas hospedadoras: reguladores transcripcionales y vesículas de membrana
(2024-04-12) Ayala García, Paula; Ollero Márquez, Francisco Javier; Pérez Montaño, Francisco de Asís; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
La simbiosis rizobio-leguminosa se define como la relación simbiótica mutualista que se establece entre las plantas leguminosas y bacterias del suelo llamadas rizobios. En esta simbiosis, los rizobios colonizan las raíces de las plantas leguminosas e inducen la formación de unas estructuras especializadas conocidas como nódulos, donde convierten el nitrógeno atmosférico (N2) a compuestos nitrogenados que son asimilables por la planta (NH4+). La proteína regualdora NodD de los rizobios juegan un papel crucial en la especificidad rizobioleguminosa y en el reconocimiento de ambos organismos en la rizosfera. Este regulador se activa en presencia de ciertos flavonoides presentes en los exudados radiculares. Una vez activo, lleva a cabo la transcripción de los genes de nodulación (genes nod), que codifican para proteínas encargadas de la síntesis y secreción de los factores de nodulación (NFs). En la rizosfera, los NFs son reconocidos por la planta, lo que desencadena la entrada de los rizobios a la raíz y el desarrollo de los nódulos. Rhizobium tropici CIAT 899, organismo de estudio en esta Tesis Doctoral, contiene en su genoma cinco copias del gen nodD, una característica atípica en la mayoría de rizobios. Además, esta estirpe rizobiana destaca por la capacidad de sintetizar y secretar NFs en presencia de apigenina (vía NodD1) y bajo un estrés osmótico independientemente de la presencia de un flavonoide activador (vía NodD2). Estudios previos han demostrado que el mismo grupo de genes simbióticos se activa en ambas condiciones, a excepción de dos genes, los genes nodD2 y rtciat899_pb01075, que se activan únicamente en condiciones de estrés osmótico. En la presente Tesis se ha estudiado el papel del gen rtciat899_pb01075 (onfD), que codifica para un regulador transcripcional de la familia AraC. Así se ha demostrado que OnfD es esencial en la síntesis de NFs en CIAT 899 bajo estrés osmótico, y que podría interaccionar con el regulador NodD2 llevando a cabo conjuntamente la activación transcripcional de los genes nod en presencia de estrés osmótico. Asimismo, con el objetivo de estudiar el papel de cada uno de los reguladores NodD de CIAT 899, se ha desvelado que la actuación de NodD2 en la activación de los genes simbióticos en presencia de estrés osmótico no se debe a la activación de este regulador por acción de una molécula señal en el medio, si no a un aumento de sus niveles citoplasmáticos, es decir, a un aumento de la expresión de nodD2. Además, la expresión constitutiva del gen nodD2 de CIAT 899 resulta en un aumento del rango de hospedador en otros rizobios. Parte de la presente Tesis Doctoral también se destina al estudio de las vesículas de membrana (MVs) liberadas por los rizobios en diferentes etapas del proceso simbiótico. De este modo, se describen dos protocolos que permiten asilar y analizar las MVs liberadas por CIAT 899 tanto en vida libre en presencia de un flavonoide activador, como a partir de los nódulos desarrollados en simbiosis con la leguminosa Phaseolus vulgaris. Como consecuencia de los estudios mencionados anteriormente, esta Tesis reúne un compendio de 4 publicaciones: dos artículos científicos y dos capítulos de libros.
Caracterización de los genes implicados en la síntesis de ceras en semillas de girasol (Helianthus annuus)
(2024-01-19) DeAndrés Gil, Cristina; Moreno Pérez, Antonio Javier; Salas Liñán, Joaquín Jesús; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología; Universidad de Sevilla. Departamento de Biología Vegetal y Ecología
El girasol (Helianthus annuus L.) es una planta oleaginosa de alto valor comercial. El principal producto derivado de su cultivo es el aceite extraído de sus semillas, destinado principalmente al consumo humano. El aceite de girasol debe someterse a un proceso de refinado para eliminar compuestos minoritarios y adecuar el producto final a las exigencias del consumidor. Las ceras son un subproducto del proceso de refinación, y sus propiedades fisicoquímicas las convierten en compuestos de gran interés industrial. Las ceras son componentes de las capas lipídicas de la cutícula de las plantas, y desempeñan un papel crucial en su adaptación y supervivencia. En el girasol, las ceras se encuentran principalmente en el pericarpio o cubierta de la semilla, donde contribuyen a la protección del embrión y la viabilidad de la semilla. La síntesis de ceras en las plantas tiene lugar en el retículo endoplasmático a partir de precursores de ácidos grasos de cadena muy larga (VLCFA), e implica dos reacciones enzimáticas consecutivas. En primer lugar, los VLCFA se reducen a alcoholes grasos de cadena larga por las reductasas de ácidos grasos (FAR). A continuación, estos alcoholes de cadena larga se esterifican con moléculas de acil-CoA por las sintasas de ceras (WS), para formar ceras como producto final. Los avances en la identificación y caracterización de los genes responsables de la síntesis de ceras en diversos organismos ofrecen la posibilidad de utilizar procesos biotecnológicos para lograr una producción sostenible y a gran escala de estos compuestos en bacterias, levaduras o plantas oleaginosas. El objetivo general de este trabajo es la caracterización de las enzimas implicadas en la biosíntesis de ceras en semillas de girasol, las reductasas de ácidos grasos y sintasas de ceras, así como el desarrollo de un nuevo método preciso de análisis de ceras de girasol. Se han identificado y estudiado 4 genes FAR (HaFAR2, HaFAR3, HaFAR4 y HaFAR5) y 2 genes WS (HaWS8 y HaWS11), aquellos que mostraron mayores niveles de expresión en semillas de girasol, y dichos genes se han expresado heterólogamente en Saccharomyces cerevisiae para comprobar su funcionalidad y evaluar su impacto en el perfil lipídico. Además, se han generado plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresaban HaFAR2, y se ha analizado la composición lipídica de sus hojas. También se ha estudiado la actividad de las enzimas HaWS in vitro, y determinado sus constantes cinéticas. Asimismo, se han modelado in silico las estructuras de cada proteína con sustratos específicos, y se ha estudiado su localización subcelular mediante expresión transitoria en hojas de Nicotiana benthamiana. Por último, se ha estudiado el perfil de acumulación de ceras en las cubiertas de semillas de girasol, mostrando un incremento en su acumulación a lo largo del desarrollo de la semilla. Además. se ha desarrollado un nuevo método de determinación de ceras basado en la extracción directa de ceras de la superficie de las semillas de girasol y su análisis mediante cromatografía de gases acoplado a masas, aplicable también a la determinación de ceras a partir de aceite crudo de girasol. El papel de estas enzimas en la síntesis de las ceras presentes en la semilla de girasol se evaluó en base a los resultados obtenidos.
Escherichia coli infection: mechanisms and rapid detection of resistance to the association of ß-lactams with ß-lactamase inhibitors, and impact of the Sars-Cov-2 pandemic on the morbidity and mortality of intra-abdominal infection
(2023-11-03) Gálvez Benítez, Lydia; Lepe Jiménez, José Antonio; Smani, Younes; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología; Universidad de Sevilla. Departamento de Medicina
Infections by Escherichia coli in human beings produce a significant disease burden, with important morbidity and mortality, and the increasing resistance to antimicrobials is a challenge for choosing the more effective therapy. In this context, the present PhD Thesis is aimed to produce new knowledges applicable to the treatment of one of the more frequent and severe infections by E. coli¸ the intra-abdominal infections. Piperacillin-tazobactam resistance (P/T-R) is increasingly reported among E. coli isolates. The first objective was to identify the mechanisms underlying P/T-R by following up patients with E. coli complicated intra-abdominal infections (cIAI) who experienced P/T treatment failure. Four pairs of strains, clonally related from four patients, were isolated both before and after treatment with P/T dosed at 4 g/0.5 g intravenously. The P/T MIC was tested using broth microdilution, and β-lactamase activity was determined in these isolates. Whole-genome sequencing (WGS) was performed to decipher the role of blaTEM and other genes associated with P/T-R. Changes in the outer membrane protein (OMP) profile were analysed using SDS-PAGE, and blaTEM and ompC transcription levels were measured by RT-qPCR. In addition, in vitro competition fitness was performed between each pairs of strains (P/T-susceptible vs. P/T-resistant). A higher copy number of blaTEM gene in P/T-R isolates was found, generated by three different genetic events: (1) IS26-mediated duplication of the blaTEM gene, (2) generation of a small multicopy plasmid (ColE-like) carrying blaTEM, and (3) adaptive evolution via reduction of plasmid size, leading to a higher plasmid copy number. Moreover, two P/T-R strains showed reduced expression of OmpC. Currently, the detection of P/T-R relying on conventional methods is time-consuming. To overcome this issue, a cost-effective test based on MALDI-MS technology has been developed, which aims to detect P/T-R and extended-spectrum resistance to ß-lactam/ß-lactamase inhibitors (ESRI) in E. coli. Automated Clover MS Data Analysis software to analyse the protein profile spectra obtained by MALDI-MS from a collection of 248 E. coli isolates (91 P/T-resistant, 81 ESRI developers and 76 P/T-susceptible) has been used. This software allowed to preprocess all the spectra to build different peak matrices that were analysed by machine learning algorithms. The test can efficiently and rapidly (15 min) discriminate between P/T-resistant, ESRI developer and P/T-susceptible isolates and allowed the correct classification between ESRI developers from their isogenic resistance to P/T. Finally, the COVID-19 pandemic by the new SARS-CoV-2 arose new questions derived from the great challenge to the Health Systems and, specifically, in the case of the intra-abdominal infections, about of the impact of the pandemic on the management of them, and looking for data to also improve the clinical approach in these cases. The understanding of P/T-R evolution is crucial for effectively treating infected patients and preventing the spread of resistant microorganisms. Overall, the data provided by this PhD thesis point to the importance of understanding the mechanisms of resistance acquisition and its early detection in order to have an impact on mortality and morbidity in severe infections.
Estudio de la ubicuitilación del complejo MRN mediada por SCF(bTrCP/FBXW7): implicaciones biológicas
(2023-07-07) Belmonte Fernández, Alejandro; Romero Portillo, Francisco; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
El cisplatino, como otros fármacos basados en platino, se encuentra entre los compuestos más usados en las quimioterapias contra distintos tipos de cánceres. Entre sus múltiples efectos, el cisplatino se une al ADN generando una gran variedad de lesiones que provocan, en última instancia, la muerte celular. Algunas de estas lesiones, en concreto las roturas de doble cadena, pueden ser reparadas por recombinación homóloga o por unión de extremos no homólogos, provocando resistencias al fármaco. Uno de los principales intervinientes en la reparación de las roturas de doble cadena es el complejo MRN (MRE11, RAD50 y NBS1), esencial para la identificación de las roturas, el reclutamiento de diversos factores de señalización y el procesamiento, todo ello encaminado a la reparación de las mismas. El complejo MRN también interviene en otros procesos, como la reparación del ADN tras la formación de aductos o tras el colapso de horquillas de replicación. Dado su papel en el mantenimiento de la estabilidad del genoma, los defectos en los componentes del complejo MRN se han asociado con enfermedades como el cáncer. La ubicuitilación de proteínas es una modificación post-traduccional que desempeña importantes funciones en la célula: desde la degradación de proteínas vía proteasoma o lisosoma, hasta la modificación de la localización de proteínas concretas o participando en procesos de señalización. La ubicuitilación de las proteínas tiene un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis celular. Por ello, las alteraciones en la ubicuitilación de determinadas proteínas pueden contribuir a la transformación tumoral. En el proceso de ubicuitilación intervienen distintas enzimas, entre las que destaca la ligasa de ubicuitina, por ser la encargada del reconocimiento del sustrato. La ligasa de ubicuitina SCF está formada por una serie de subunidades entre las que se encuentran las proteínas F-box, cuyo papel es identificar a los sustratos específicos de esta ligasa. Dos de las proteínas F-box más destacadas de SCF son TrCP y FBXW7. Ambas son responsables de la ubicuitilación de una gran variedad de sustratos implicados en múltiples procesos celulares, y tanto estos como dichas proteínas F-box se han relacionado con diferentes aspectos de la transformación tumoral. En esta Tesis nos hemos centrado en el estudio del complejo MRN como potencial sustrato de SCF(TrCP/FBXW7). En el laboratorio se había realizado un estudio de las proteínas que interaccionaban con TrCP y FBXW7 mediante espectrometría de masas, y entre ellas estaban algunos de los componentes del complejo MRN. Ahora hemos podido confirmar que existe una asociación in vivo entre estas proteínas F-box y el complejo MRN en el núcleo de las células de mamífero. Además, tanto SCF(TrCP) como SCF(FBXW7) son capaces de ubicuitilar in vitro e in vivo ciertos componentes del complejo, por lo que este es sustratos de ambas ligasas de ubicuitina. La asociación entre TrCP y MRN ocurre a través de MRE11, que es la diana in vivo de esta proteína F-box, y está regulada por las quinasas p70S6K y GSK3. Esta última quinasa también interviene en la asociación de FBXW7 con el complejo MRN. Profundizando en el papel fisiológico de las asociaciones entre estas proteínas Fbox y el complejo MRN, pusimos de manifiesto que TrCP estimula la localización de los componentes del complejo en la cromatina, aunque se requieren más estudios para conocer la relevancia de estos resultados. Por su parte, la interacción entre FBXW7 y el complejo MRN induce la degradación del mismo por la vía de la autofagia/lisosoma. La ubicuitilación llevada a cabo por SCF(FBXW7) permite que el complejo MRN se asocie con los mediadores del flujo autofágico, p62 y LC3, en el núcleo de la célula para, posteriormente, trasladarse a los lisosomas, donde se llevará a cabo su degradación. Este proceso se potencia cuando la célula entra en apoptosis derivada del tratamiento con agentes genotóxicos. Por último, a raíz de los ensayos que realizamos estudiando el comportamiento del complejo MRN en respuesta a cisplatino, observamos en varias líneas celulares que el tratamiento con dosis subletales de cisplatino provocaba su entrada en senescencia. Sin embargo, en las líneas celulares equivalentes que sobreexpresaban TrCP se producía muerte celular, mostrando además unos niveles de p21 CIP1 inferiores a los de las correspondientes líneas silvestres. En la Tesis discutimos las implicaciones derivadas de todos estos resultados.
Optimisation of the therapeutic potential of fosfomycin against Enterobacteriaceae: characterisation of genetic and physiological factors related to resistance and antimicrobial activity
(2023-05-30) Ortiz Padilla, Miriam; Docobo Pérez, Fernando; Rodríguez Martínez, José Manuel; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
Since the discovery of the first antimicrobials, bacteria with resistance mechanisms against them have been detected. The appearance of bacterial resistance is a natural phenomenon, which has increased as a result of the use of antimicrobials. Therefore, the availability of antimicrobials does not ensure therapeutic success. Moreover, in recent decades, a progressive increase in antimicrobial resistance has occurred, and it has become a global public health problem, since there is an increase in deaths caused by or related to bacteria that present resistance mechanisms. As a result of this problem and the scarcity of new effective molecules for the treatment of multidrug-resistant bacteria, various organizations (such as WHO and FAO) are developing plans with different strategies to address the problem. These strategies include optimizing of the use of existing antimicrobials and the rescue of old antibiotics that are still active, such as fosfomycin. Fosfomycin is an old antimicrobial that can be a good therapeutic option, since it many bacteria of clinical interest remain sensitive to this antibiotic. Fosfomycin is a derivative of phosphonic acid, a hydrophilic, low molecular weight molecule. It has three carbon atoms, is soluble in water, and is similar to phosphoenolpyruvate. It is a broad-spectrum bactericidal antimicrobial that acts in the growth phase of bacteria, inhibiting the first step of cell wall peptidoglycan synthesis by binding to the enzyme MurA. Fosfomycin must penetrate the cytoplasm to reach its target, MurA, producing bactericidal effect. For this purpose, two membrane transporters GlpT and UhpT are described, whose physiological function in bacteria is the uptake of phosphorylated carbon sources and expel inorganic phosphate (Pi). The regulation and activity of these transporters is fundamental to the mechanism of action of fosfomycin and, therefore, to fosfomycin resistance. The transcription of both transporters is induced by their own substrate, in addition to the AMPc-CRP metabolism regulator complex, and they are also activated by the FNR regulator, a bacterial regulator under anaerobic conditions. The GlpT transporter has the function of introducing glycerol-3-phosphate (G3P), this molecule binds to the GlpR repressor, causing the loss of affinity for promoters of the glp regulon genes, such as glpT. On the other hand, UhpT transports hexose-phosphate, mainly glucose-6-phosphate (G6P). This molecule is detected by a two-component system, UhpB and C, and when this occurs, it phosphorylates UhpA, which binds to the uhpT promoter, inducing its transcription. Thus, in the susceptibility assays G6P must be added to induce the presence of this transporter, as the susceptibility results obtained in this way are more consistent with susceptibility breakpoints and therapeutic success. Fosfomycin resistance mechanisms can be plasmid and chromosomal mediated, as modifications of MurA, the presence of peptidoglycan recycling pathways, alteration of fosfomycin permeability or the presence of fosfomycin-modifying enzymes. Chromosomal mediated fosfomycin resistance usually occurs in a stepwise mode, often generating complex phenotypes difficult to interpret. In this sense, to better understand the mechanisms of resistance to fosfomycin in Klebsiella pneumoniae and to optimize the use of this antimicrobial, the following study was carried out. The objectives were to characterize the role of the genes uhpT, glpT, and fosA in resistance to fosfomycin in K. pneumoniae and to evaluate the use of phosphonoformate sodium (PPF) due to its ability to inhibit the FosA enzyme, in combination with fosfomycin. For this purpose, seven clinical isolates of K. pneumoniae and the reference strain (ATCC 700721) were used, and their genomes were sequenced. Mutants for transporters and fosA were constructed from two isolates of K. pneumoniae ATCC 700721. The susceptibility test to fosfomycin was performed using the gradient strip method. Synergy between fosfomycin and PPF was studied by checkerboard assay and analyzed with SynergyFinder. Spontaneous frequencies of occurrence of fosfomycin and PPF mutants, in vitro activity by growth curves with gradient concentrations of fosfomycin with and without PPF, and time-kill assays with and without PPF were also evaluated. The fosfomycin MICs of the clinical isolates ranged from 16 to 1,024mg/L. The addition of 0.623 mM PPF reduced the MIC by 2 to 8-times. Deletion of fosA gene led to a 32-fold decrease. Synergistic activities were observed with the combination of fosfomycin and PPF (most synergistic area at 0.623mM). The lowest frequencies of fosfomycin resistant mutants were found in ΔfosA mutants with frequency ranging from 1.69x10-1 to 1.60x10-5 for 64 mg/L fosfomycin. Finally, the growth monitoring and time-kill assays, fosfomycin showed bactericidal activity only against fosA mutants and not with the addition of PPF. The study concludes that inactivation of the fosA gene results in decreased resistance to fosfomycin in K. pneumoniae. The pharmacological approach using PPF did not achieve sufficient activity and the effect decreased with the presence of other fosfomycin resistant mutations. The second chapter of the Thesis follows the line of optimizing the use of fosfomycin with the addition of an adjuvant, and to better understand how the regulation of fosfomycin transporters may affect their activity. The main objective was to evaluate the role of glycerol at therapeutically relevant concentrations in combination with fosfomycin in Escherichia coli, since this molecule is clinically used as a treatment for example for elevated intracranial pressure and can induce glpT expression. For this purpose, a collection of isogenic mutants of fosfomycinrelated genes was evaluated in E. coli strains. The induction of fosfomycin transporters was evaluated and susceptibility tests, interaction assays, and time-to-death assays were performed. Our results showed that glycerol allows the activation of the GlpT transporter, but this induction is delayed in time and is not homogeneous in all E. coli strains throughout the bacterial population, leading to contradictory results in terms of fosfomycin activity. The susceptibility assays showed increased fosfomycin activity with glycerol in the disc diffusion assay, but not in the agar dilution or broth microdilution assays. Similarly, in time-kill assays, the effect of glycerol was absent because of the appearance of fosfomycin-resistant subpopulations. In conclusion, glycerol may not be a good candidate for use as an adjuvant to fosfomycin. Finally, to better understand physiological factors that affect fosfomycin transporters activity, the aim of third chapter was to evaluate the in vitro activity of fosfomycin under different physiological concentrations of inorganic phosphate (Pi). For this purpose, the wild-type strain BW25113, four isogenic mutants (ΔglpT, ΔuhpT, ΔglpT-uhpT and ΔphoB) and six clinical isolates of E. coli with different fosfomycin susceptibilities were used. Susceptibility was assessed by agar dilution using Mueller-Hinton agar (Pi=1mM) and supplemented with Pi (13 and 42mM, minimum and maximum urinary concentrations of Pi) and/or glucose-6-phosphate (25mg/L). The promoter activity of the fosfomycin transporter was assessed by monitoring fluorescence accumulation using pUA66-PglpT::gfpmut2 or pUA66-PuhpT::gfpmut2 plasmids in standard Mueller-Hinton broth (MHB) supplemented with Pi (13 or 42mM) ± glucose-6-phosphate. Fosfomycin activity was quantified spectrophotometrically at 24 hours as before with glucose-6-phosphate, and fosfomycin ranged from 1 to 1024mg/L. The EC50 of fosfomycin was estimated and compared. Time-kill assays were performed with fosfomycin concentrations of 307 (plasma Cmax), 1053 and 4415mg/L (urinary Cmax range), using MHB with 28mM Pi (mean urinary concentration) +25mg/L glucose-6-phosphate. The results showed that all strains decreased fosfomycin susceptibility linked to increasing Pi concentrations: 1-4-log2 dilution differences from 1 to 13mM, and 1-8-log2 dilution differences at 42 mM Pi. Changes in phosphate concentration did not affect the expression of fosfomycin transporter promoters. Also, increasing Pi concentrations resulted in a higher bacterial viability EC50 of fosfomycin, except against the ΔglpT-uhpT mutant strain. Therefore, the present study concludes that Pi variations in physiological fluids may reduce the activity of fosfomycin against E. coli. Also, the elevated urinary Pi concentrations may explain the failure of oral fosfomycin in non-wild but fosfomycin-susceptible E. coli strains.
Strategies to potentiate bactericidal antimicrobial activity based on the suppression of bacterial stress response systems
(2023-05-25) Díaz Díaz, Sara; Pascual Hernández, Álvaro; Rodríguez Martínez, José Manuel; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
One of the major threats to human health is the emergence of antimicrobial resistance. Since the discovery of antimicrobials, new mechanisms of resistance have emerged. Various strategies are being studied to combat the emergence of resistance including the development of new antimicrobial, use of adjuvants to enhance susceptibility, genome-editing technologies, and phage therapy. However, since microorganisms can evolve rapidly to ensure their survival, new resistance mechanisms appear frequently. Although resistance mechanisms in bacteria are usually expressed phenotypically, this expression may not affect the whole bacterial population equally. This phenomenon is known as heteroresistance. Heteroresistance is defined as the presence of a heterogeneous population of bacteria with one or multiple subpopulations showing higher levels of antimicrobial resistance relative to the main population. This makes it more difficult to categorize clinical isolates according to the level of resistance and can lead to treatment failure. Different strategies are therefore needed to combat resistance and heteroresistance. The SOS response is a coordinated cellular response to genotoxic damage that may contribute to the evolution of antimicrobial resistance, since genes related to DNA repair and recombination processes are transcribed during the SOS response. Certain antimicrobials, such as quinolones and β-lactams, induce the SOS response. Suppression of the SOS response has been shown to enhance the bactericidal activity of antimicrobials such as quinolones. Furthermore, bactericidal antimicrobials such as quinolones are also associated with the accumulation of reactive oxygen species (ROS) under aerobic conditions, inducing reactions that can contribute to cellular damage. Microorganisms contain detoxification systems able to detoxify ROS. The objectives of this thesis were threefold: (i) to evaluate the synergistic effect of suppression of the SOS response (by suppressing the recA gene) and overproduction of ROS (by suppressing detoxification systems or stress regulatory systems) in increasing the activity and lethality of fluoroquinolones; (ii) to evaluate the interplay between the SOS response (DNA repair and recombination processes) and detoxification systems in the evolution of ciprofloxacin resistance under gradual or sudden antimicrobial exposure; and (iii) to determine the impact of deletion of the recA gene (the SOS response activator, also required for homologous recombination in E. coli) on the reversal of heteroresistance. For the first and second objectives, a set of E. coli mutants was prepared. In E. coli BW25113, these included single mutants with suppression of the SOS response (ΔrecA), detoxification systems (ΔkatG, ΔkatE, ΔsodA, ΔsodB, ΔahpC) or stress regulatory systems (ΔoxyR, ΔrpoS); double deletion mutants with both recA and a detoxification system suppressed (ΔkatG/ΔrecA, ΔkatE/ΔrecA, ΔsodA/ΔrecA, ΔsodB/ΔrecA, ΔahpC/ΔrecA, ΔoxyR/ΔrecA, ΔrpoS/ΔrecA); double deletion mutants with two detoxification systems suppressed (ΔkatG/ΔkatE, ΔsodA/ΔsodB) and triple deletion mutants (ΔkatG/ΔkatE/ΔrecA).In E. coli BW15, single (ΔkatG, ΔsodA, ΔrecA) and double deletion (ΔkatG/ΔrecA, ΔsodA/ΔrecA) mutants were prepared. The BW15 strain has quinolone resistance mechanisms, carrying amino acid changes in GyrA (D87G), GyrB (E465D), and ParE (K390N), as well as a deletion in the marR gene. For the third objective, 23 clinical isolates of E. coli of bacteremic or urinary origin were used, among them eight isolates belonging to the high-risk clone ST131. A synergistic sensitization effect was found for ciprofloxacin when the SOS response (recA gene) and detoxification or stress regulatory systems were suppressed. However, this effect was not always replicated for other fluoroquinolones. Unexpectedly, no further sensitization was found for BW15 strain mutants. Suppression of the recA gene with detoxification system genes or stress regulatory system genes prevented bacterial growth in the presence of sublethal concentrations of ciprofloxacin and had an enhanced bactericidal effect on E. coli. After sudden exposure to ciprofloxacin, suppression of the SOS response, through deletion of the recA gene, and detoxification systems helps to reduce the evolution of resistance in E. coli. After gradual exposure to ciprofloxacin, suppression of the SOS response helps to reduce the evolution of resistance. Under the latter condition, however, suppression of detoxification systems, alone or in combination with the SOS response, may favour mutagenesis and the evolution of resistance to ciprofloxacin. In terms of heteroresistance, the percentages of clinical isolates expressing heteroresistance by disk diffusion varied from 30% to 100%, depending on the antimicrobial tested. Deletion of the recA gene resulted in reversal of heteroresistance to antimicrobials such as quinolones and β-lactams. Finally, heteroresistance was associated with tandem amplification of resistance genes, such as qnrA1, or an increase in the copy number of plasmid-borne resistance genes such as blaTEM-1B.
Factores de movilización y disminución del riesgo en la biodisponibilidad y degradación bacteriana de contaminantes orgánicos en sistemas porosos
(2023-03-30) Castilla Alcántara, José carlos; Ortega Calvo, José Julio; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
En esta tesis doctoral se ha llevado a cabo una investigación básica sobre el proceso de biorremediación enfocado a sistemas porosos contaminados con hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs). Se han estudiado diferentes factores de movilización implicados en el proceso, así como de los riesgos asociados a dicha movilización, dentro del contexto de su aplicación como innovaciones en la biorremediación. La hipótesis general de partida de esta tesis doctoral ha sido que la movilización de estos contaminantes hidrófobos y de las bacterias capaces de degradarlos puede tener efectos positivos sobre las tasas de biodegradación, a través de un aumento de la biodisponibilidad y de la bioaccesibilidad a los focos de contaminación. Sin embargo, la aplicación de estas técnicas también puede tener consecuencias negativas, derivadas de la movilización, tanto de los contaminantes como de los microorganismos que pueden generar problemas a medio y largo plazo. De esta forma, se ha determinado, por una parte, que la aplicación de técnicas electrocinéticas puede tener un efecto sobre la movilización de los HAPs, aumentando su disponibilidad para la biodegradación. Por otra parte, se ha investigado cómo los diferentes patrones de movilidad bacteriana, originados como respuestas tácticas, pueden modularse para tener efectos positivos sobre el transporte de los microorganismos hacia los contaminantes de difícil acceso, es decir, aquellos que se encuentran adsorbidos en los microporos del suelo. Por último, se ha realizado una prueba de concepto sobre el control del riesgo generado por estos factores de movilización mediante el empleo de plantas en asociación con las bacterias y de biocarbón. En los estudios sobre electrocinética, se comprobó que la aplicación de una corriente eléctrica de baja intensidad en un sistema poroso contaminado con naftaleno permitía una mayor interacción de la bacteria Pseudomonas fluorescens LP6a con el contaminante, provocando un aumento en las tasas de biodegradación del naftaleno. Estos experimentos se llevaron a cabo en un nuevo sistema de columnas electrocinéticas en las que el contaminante se introdujo en un reservorio al inicio del influente, controlando la exposición de bacterias depositadas en las columnas. El estudio de la movilización celular se realizó mediante ensayos capilares para determinar la capacidad quimiotáctica de la estirpe Pseudomonas putida G7 frente a diferentes compuestos. Mientras que salicilato, ácido γ-aminobutírico (GABA), citrato y exudados de raíces artificiales (AREs) causaron una respuesta de atracción celular, las nanopartículas de Fe (nZVIs) y glucosa indujeron una respuesta de repelencia e hipermovilidad, respectivamente. El estudio de la capacidad de movilización de la estirpe se realizó como paso previo a los experimentos para testar la capacidad de transporte bacteriano a través de microporosidades mediante el empleo de un novedoso sistema de biorreactores de membrana. La utilización de GABA y en especial de AREs, provocó una movilización bacteriana muy significativa a tamaños de poro considerados restrictivos (5 μm y 3 μm), mientras que, para el resto de sustancias empleadas, la respuesta celular fue moderada. La hipótesis de que un aumento del transporte puede provocar un aumento de la biodegradación de los contaminantes por una mayor accesibilidad, se realizó mediante técnicas de radiorespirometría para naftaleno y de fluorimetría para pireno en biorreactores. En ambos casos, GABA y AREs provocaron aumentos en las tasas de degradación a tamaños de poro de 5 μm. También se comprobó un aumento de la biodegradación de pireno en sistemas porosos saturados mediante el empleo de columnas de percolación. Los posibles riesgos asociados a estos mecanismos de recuperación de suelos se analizaron en un experimento de invernadero modelo con arena contaminada con pireno, donde el empleo de girasoles en conjunto con P. putida G7 y una capa de biocarbón provocaron una menor detección del compuesto en los lixiviados y una mayor translocación en plantas con la consiguiente disminución del riesgo asociado a la biorremediación.
Actividad de biocidas frente a aislados de Klebsiella pneumoniae productor de carbapenemasa
(2022-10-27) Gual de Torrella Bennasar, Ana; Pascual Hernández, Álvaro; Fernández Cuenca, Felipe Manuel; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
La diseminación de clones epidémicos de Klebsiella pneumoniae productor de carbapenemasa (Kp-PC) es un problema de salud pública mundial, con importantes repercusiones clínicas, terapéuticas y epidemiológicas. El éxito de estos clones epidémicos se relaciona con múltiples factores, como la adquisición de genes de resistencia antimicrobiana, destacando los que codifican carbapenemasas. Por otro lado, factores que intervengan en la capacidad de adaptación a condiciones ambientales adversas, podrían contribuir, en mayor o menor medida, en su comportamiento epidémico. Entre estos factores ambientales se incluye, la sensibilidad o resistencia a biocidas (SRB) y la capacidad de producir biopelículas. En este proyecto se ha estudiado la SRB y la capacidad de formación de biopelícula en aislados, epidémicos y no epidémicos, de Kp-PC. Se ha observado que la actividad de los biocidas evaluados frente a Kp-PC (povidona yodada, digluconato de clorhexidina, cloruro de benzalconio, hipoclorito de sodio, etanol, solución hidroalcohólica y triclosán), determinada mediante microdilución, es independiente del tipo de clon (epidémico o no epidémico), por lo que no se puede relacionar el comportamiento epidémico con la SRB. Tampoco se ha relacionado la presencia de los genes de bombas de expulsión evaluados (cepA, acrAB, kpnEF, oqxAB, smvAR, qacEΔ1, qacE y qacA) con los valores de CMI de los biocidas estudiados. Respecto a la capacidad de formación de biopelícula, se ha observado que a temperatura ambiente (25ºC), los aislados de clones epidémicos tienen una capacidad de formación de biopelículas superior a la de los aislados de clones no epidémicos. Además, en cuatro aislados de clones epidémicos (ST512/KPC-3, ST258/KPC-3, ST15/OXA-48 y ST11/OXA-48) se ha analizado la viabilidad y dinámica de formación de la biopelícula y se ha observado que a 25ºC permanecen viables durante 2 meses. Por otra parte, se ha estudiado el operón que codifica la fimbria de tipo 3 (mrkABCDF) y se ha comprobado que está altamente conservado en los aislados de Kp-PC estudiados. Además, se ha observado que la expresión relativa del gen mrkA está asociada con la capacidad de formación de biopelícula. Finalmente, respecto al efecto de los biocidas en la formación de biopelícula se ha observado que los aislados de clones epidémicos analizados, son capaces de permanecer viables hasta 2 meses en biopelículas expuestas a las concentraciones subletales de los biocidas estudiados a temperatura ambiente. También, se ha observado que concentraciones subletales de clorhexidina y triclosán pueden favorecer la formación de biopelícula a temperatura ambiente. Por otro lado, povidona yodada es el biocida con mayor efecto en la reducción de la capacidad de formación de biopelículas y de la viabilidad en las mismas.
Búsqueda de nuevos sustratos de SCF-bTrCP implicados en tumorigénesis
(2015-02-10) Herrero Ruiz, Joaquín; Romero Portillo, Francisco; Tortolero García, María Dolores; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
Esta Tesis se centra en la búsqueda de nuevos sustratos de SCFbTrCP, una ligasa de ubicuitina esencial en la regulación del ciclo celular que se encuentra sobreexpresada en multitud de tumores, con el fin de hallar nuevos marcadores tumorales y/o dianas terapéuticas. Tras realizar dos escrutinios masivos determinando las proteínas que se asocian a bTrCP, la subunidad de la ligasa responsable de la interacción con los sustratos, confirmamos la asociación de varios potenciales sustratos para finalmente profundizar en uno de ellos. Concretamente estudiamos Sar1B, una GTPasa pequeña que interacciona con proteínas que intervienen en el transporte desde el retículo endoplásmico al aparato de Golgi, RAD50, que junto con MRE11 y NBS1 forman un complejo que se une a las roturas de doble cadena en el ADN, y las quinasa PLK1, GSK3 y CDK1 implicadas en la regulación del ciclo celular. Tras ratificar que todas estas proteína interaccionan in vivo con bTrCP y que al menos algunas de ellas son potenciales sustratos de la ligasa, nos centramos en el estudio de CDK1. CDK1 es una quinasa de serina/treonina que juega un papel clave en la progresión del ciclo celular. Fundamentalmente está implicada en la transición G2/M, aunque también en la progresión del ciclo en G1 y en la transición G1/S. Debido a su importancia, CDK1 está fuertemente regulada, aunque no se conoce con detalle cómo se regula su estabilidad. En esta Tesis mostramos que CDK1 interacciona in vivo con bTrCP, que la ligasa lo ubicuitila tanto in vitro como in vivo formando cadenas de poliubicuitinas heterotípicas y que se degrada a través del lisosoma. Además, identificamos el sitio de unión a bTrCP y descubrimos que el daño en el ADN afecta a la estabilidad de la proteína dependiendo del tipo celular. En concreto, determinamos que en ciertos tipos celulares poco tumorigénicos, el tratamiento con el agente quimioterapéutico doxorubicina induce la degradación de la proteína y provoca apoptosis, y en otros muy tumorigénicos la estabiliza. Esto nos da una herramienta para detectar la malignidad de los tumores y ajustar el tratamiento para obtener una mejor respuesta.
Heterorresistencia a fosfomicina en Escherichia coli: bases moleculares y efecto en su potencial terapéutico
(2022-03-15) Portillo Calderón, Inés María; Docobo Pérez, Fernando; Pascual Hernández, Álvaro; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
En las últimas décadas, el aumento progresivo de la resistencia a los antimicrobianos se ha convertido en un problema mundial de salud pública. Consecuencia de ello y de la escasez de nuevas moléculas efectivas para el tratamiento de bacterias multirresistentes, surge como estrategia el rescate de antiguos antimicrobianos aún activos como la fosfomicina. La resistencia cromosómica a fosfomicina se trata de un fenómeno que ocurre de forma escalonada, complejo de estudiar e interpretar, que se complica sobre todo por la presencia de factores como la heterorresistencia, la cual se corresponde con un fenotipo cuya definición es heterogénea y controvertida. En general, se considera como la presencia de subpoblaciones que muestran diferentes niveles de sensibilidad a un antimicrobiano. Nicoloff y colaboradores demostraron la asociación entre la heterorresistencia a diversos antimicrobianos (sin tener en cuenta la fosfomicina) con la presencia de amplificaciones espontáneas en tándem de genes de resistencia conocidos. En relación con esto, otro mecanismo que permite un incremento en la tasa de mutación tiene como origen defectos en los sistemas de reparación del ADN en bacterias, mostrando estas bacterias hipermutadoras una prevalencia entre aislados clínicos que oscila entre un 1% y un 60%, dependiendo de los estudios. Por otro lado, ensayos in vitro no farmacocinéticos/farmacodinámicos han demostrado que los aislados heterorresistentes a fosfomicina pueden sobrevivir a altas concentraciones de fosfomicina, dependiendo de la CMI de las subpoblaciones, la tasa de mutación y el inóculo bacteriano; sin embargo, se desconoce el impacto clínico de estos aislados. Numerosos estudios in vitro e in vivo han demostrado la eficacia de la combinación de fosfomicina/amikacina frente a bacterias multirresistentes; sin embargo, no se ha explorado la eficacia de esta combinación frente a aislados heterorresistentes a fosfomicina. Los objetivos de este trabajo fueron conocer el efecto de la combinación de mutaciones por deleción en los genes del sistema de reparación del ADN y en los relacionados con los mecanismos de resistencia a fosfomicina para explicar los posibles mecanismos subyacentes de los diferentes fenotipos de heterorresistencia a fosfomicina en Escherichia coli, así como estudiar la eficacia de dosis humanizadas de fosfomicina y amikacina intravenosas en monoterapia y en combinación frente a aislados de E. coli heterorresistentes a fosfomicina en un modelo de infección con fibra hueca (HFIM). Para ello se utilizaron 11 aislados clínicos de E. coli junto con mutantes isogénicos de deleción simple y doble en genes del sistema de reparación del ADN de E. coli y genes relacionados con resistencia a fosfomicina. La CMI a fosfomicina se estableció mediante tira de gradiente y microdilución en caldo. Se determinó la frecuencia de mutantes para rifampicina (100 mg/L) y fosfomicina (50 y 200 mg/L). Utilizando dos inóculos diferentes de partida, se evaluó la actividad in vitro a fosfomicina durante 24 horas mediante curvas de crecimiento (0,5-512 mg/L) y curvas de letalidad (64 y 307 mg/L). Posteriormente, se seleccionaron 6 de los 11 aislados clínicos previos con fenotipo hipermutador y heterorresistente a fosfomicina y se determinó la frecuencia de aparición de mutantes para rifampicina (100mg/L), fosfomicina (50 y 200mg/L) y amikacina (32 mg/L). Los valores de CMI para fosfomicina y amikacina se evaluaron mediante dilución en agar, tira de gradiente y microdilución en caldo. El estudio de sinergia para fosfomicina y amikacina se realizó mediante ensayos de tablero de ajedrez y curvas de letalidad, utilizando distintas concentraciones. Finalmente, la eficacia de fosfomicina (8g/Q8h) y amikacina (15mg/kg/Q24h) en monoterapia y en combinación se evaluó mediante el modelo de infección in vitro de HFIM. De los resultados de este trabajo se obtuvieron las siguientes conclusiones: 1. El origen del fenotipo de heterorresistencia a fosfomicina pueden explicarse parcialmente por una elevada frecuencia de aparición de mutantes en combinación con la presencia de mecanismos de resistencia de bajo nivel a este antimicrobiano. 2. El grado de la frecuencia de aparición de mutantes se correlaciona con la variabilidad en la proporción y CMI de las subpoblaciones heterorresistentes a fosfomicina en aislados de E. coli, teniendo un mayor impacto en aquellos aislados con alteraciones en genes relacionados con resistencia a fosfomicina. 3. El estudio de sensibilidad a fosfomicina mediante tiras de gradiente es un método eficaz para observar la variabilidad y el gradiente de heterorresistencia a este antimicrobiano, siendo el ensayo mediante microdilución más representativo de la sensibilidad de la población bacteriana general. 4. Los resultados de los ensayos realizados en los modelos de infección in vitro en HFIM con aislados de E. coli heterorresistente a fosfomicina demuestran que puede existir un riesgo de fracaso terapéutico con el uso de amikacina (15 mg/kg/24h) o fosfomicina (8g/8h) en monoterapia. 5. El estudio in vitro en HFIM demuestra que la terapia combinada de fosfomicina (8g/8h) y amikacina 15 mg/kg/24h, es eficaz frente a aislados de E. coli heterorresistente a fosfomicina, tanto frente a cepas normomutadoras como hipermutadoras, disminuyendo rápidamente la carga bacteriana y previniendo la aparición de subpoblaciones resistentes.
Fusariosis de los cultivos de la fresa y el espárrago en España: caracterización y métodos de control
(2021-10-28) Lastra Alcalde, Eduardo de la; Capote Maínez, María Nieves; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
La fresa y el espárrago son dos cultivos hortícolas de gran importancia económica y social en Andalucía. Ambos cultivos se ven afectados por hongos de suelo del género Fusarium que merman su producción, provocando pérdidas económicas en el sector. El complejo de especies de Fusarium solani (FSSC) es el agente causal de la podredumbre de raíz y corona de fresa. A su vez, distintas especies del género Fusarium (F. proliferatum, F. oxysporum f. sp. asparagi y F. redolens) están involucradas en el síndrome del decaimiento del espárrago (ADS, por sus siglas en inglés ―Asparagus Decline Syndrome‖). En esta Tesis se ha llevado a cabo la caracterización de las especies del FSSC presentes en las dos áreas productoras de fresa en España, viveros de producción de planta de las provincias de Ávila, Segovia y Valladolid y campos de producción de fruto de la provincia de Huelva, a través de un abordaje molecular (identificación de las especies por secuenciación molecular, determinación de la diversidad genética y la estructura de la población mediante análisis filogenético) y biológico (determinación de los grupos de compatibilidad vegetativa (VCG, por sus siglas en inglés ―Vegetative Compatibility Group‖)) (Capítulo I). Asimismo, se han desarrollo protocolos de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para disponer de herramientas moleculares fiables para la detección específica y cuantificación del FSSC en el cultivo de la fresa (Capítulo II) y de las principales especies de Fusarium implicadas en el ADS: F. proliferatum, F. oxysporum y F. redolens (Capítulo III). Estos protocolos de qPCR se han aplicado 1) como herramientas de diagnóstico fiable de plantas sintomáticas en campos de fresa y espárrago; 2) como métodos de control preventivo y análisis de riesgo de enfermedades, mediante la detección y cuantificación de los hongos patógenos en suelo y agua de riego de fincas de producción; 3) para la evaluación de la eficacia de tratamientos de desinfestación de suelo basados en biosolarización, mediante la cuantificación de las densidades de inóculo de los distintos patógenos de fresa y espárrago en el suelo antes y después de los tratamientos. Asimismo, se han abordado métodos de control sostenible del ADS a través de la evaluación de bacterias rizosféricas de los géneros Bacillus, Brevibacterium y Streptomyces como potenciales agentes de control biológico de las especies de Fusarium asociadas a este síndrome (Capítulo IV).
Evolución de la resistencia a los antibióticos de S. pneumoniae, 1979-1990. Implicaciones terapéuticas
(1991-10-17) Liñares Louzao, Josefina; Perea-Pérez, Evelio J.; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
Se ha estudiado la sensibilidad de 1492 cepas de neumococo aisladas de pacientes del Hospital de Bellvitge (Barcelona) a 9 antimicrobianos. La resistencia a penicilina aumentó del 4.3% en 1979 al 40% en 1990 así como la de eritromicina del 0% en 1979 al 9.4% en 1990, mientras que la de tetraciclina y cloranfenicol descendieron del 76.1% al 37.6% la primera, y del 56.5% al 29.4% la segunda. La prevalencia de resistencia a cotrimoxazol en este estudio fue del 40%. Destaca negativamente, que el 70% de las cepas resistentes a penicilina presentaban resistencia múltiple a otros antibióticos no beta lactámicos. Todas las cepas estudiadas fueron sensibles a vancomicina, y todas menos seis, lo fueron a rifampicina. En trescientas cepas con cierto grado de resistencia a penicilina solamente imipenem, meropenem, cefotaxima, ceftriaxona y cefpiroma entre los 18 antibióticos beta lactámicos y 7 macrólidos ensayados mostraron una actividad superior a la de la penicilina.
Betalactamasas de espectro extendido en enterobacterias aisladas de muestras clínicas de hospitales españoles
(2007-02-06) Hernández Bello, José Ramón; Pascual Hernández, Álvaro; Martínez Martínez, Luis; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
En 1985, se describió la primera betalactamasa de espectro extendido (BLEE). En España la primera BLEE fue descrita en 1988. Desde entonces estas betalactamasas se han diseminado por todo el mundo, gracias a la movilidad de los plásmidos en los que se encuentran. Hasta el momento de realizar este estudio no existía una información adecuada sobre la importancia de las BLEE a nivel nacional en España. El trabajo de investigación recogido en la presente Tesis Doctoral ha permitido obtener información de interés sobre aspectos fundamentales que rodean a este fenómeno: 1,- La prevalencia de E.coli y K.pneumoniae productoras de BLEE durante el periodo de estudio ha sido del 0.5 y el 2.7%, respectivamente. 2,- Se ha encontrado una amplia distribución de las BLEE en los distintos hospitales participantes. 3,- Ls BLEE detectadas con mayor frecuencia han sido CTX-M-9, SHV-12 y CTX-M-14.
Investigaciones para mejorar la calidad de las aceitunas aderezadas en verde, estilo español o sevillano con especial atención al producto envasado
(1967-12-01) González Pellisó, Fermina; Rodríguez de Velasco, Julián; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
Desarrollo del uso terapeútico de Piocinas tipo R en el tratamiento de infecciones por Pseudomonas aeruginosa multirresistente
(2021-02-03) Redero Cascón, María del Mar; Blázquez Gómez, Jesús; Prieto Márquez, Ana Isabel; Aznar Martín, Javier; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
La aparición y diseminación de cepas extensivamente-drogo-resistentes (XDR) junto con el desarrollo de biopelículas hacen que las infecciones por Pseudomonas aeruginosa supongan un auténtico desafío terapéutico. Para superar este escenario, las bacteriocinas se han propuesto como posibles alternativas al tratamiento antibiótico común. Por ello, el objetivo de esta tesis ha sido analizar la actividad de las piocinas R en infecciones por P. aeruginosa. En la primera parte de esta tesis se ha analizado la actividad de las piocinas R frente a aislados clínicos de Pseudomonas aeruginosa de pacientes con fibrosis quística y otras fuentes con distintos perfiles de sensibilidad, así como el estudio de correlación e interacción de las piocinas R con otros antibióticos. Nuestros datos sugieren que las cepas de P. aeruginosa procedentes de pacientes con fibrosis quística son más sensibles a las piocinas R que las de otros orígenes y no se encontraron interacciones entre las piocinas R y otros antibióticos usados en la práctica clínica habitual. En la segunda parte, se estudió la actividad de las piocinas R en biofilms y en un modelo murino de neumonía utilizando un clon de alto riesgo de P. aeruginosa. Los resultados destacan la fantástica actividad de las piocinas R en el biofilm, así como en resolver una neumonía aguda en el modelo animal propuesto. Este trabajo destaca el uso potencial de las piocinas R como agentes terapéuticos, solas o como adyuvantes en el tratamiento convencional. Por tanto, podría ser factible considerar a las piocinas R como una posible alternativa terapéutica en infecciones por P. aeruginosa XDR, donde las alternativas de tratamiento son muy limitadas.
RNA Helicases in 60S Ribosomal Subunit Biogenesis in Saccharomyces cerevisiae
(2020-11-10) Contreras Fernández, Julia Mª; Villalobo Polo, Eduardo; Cruz Díaz, Jesús de la; Universidad de Sevilla. Departamento de Genética; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
The ribosomes are the cellular organelles responsible for translating messenger RNA (mRNA) to proteins. In eukaryotic organisms, the ribosomes are composed by two subunits: the large subunit and the small subunit that come together to make a complete ribosome. The biogenesis of eukaryotic cytoplasmic ribosomes is a very complex process. The eukaryotic organism where this process has been best studied is the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. This microorganism is considered a model organism of study due to its low complexity, rapid growth and dispersion of its cells. In S. cerevisiae, the large subunit or 60S is composed by three rRNAs called 25S, 5.8S and 5S and about 46 ribosomal proteins; the small subunit or 40S is composed by only one rRNA called 18S and about 33 ribosomal proteins. The ribosome biogenesis process is not only complex, but it is also compartmentalized. The precursors of rRNA (pre-rRNA) are transcribed in the nucleolus by the RNA polymerase I (25S, 5.8S y 18S) and by the RNA polymerase III (5S). Along the processing of the pre-rRNAs take place accurate endo- and exonucleolytic reactions, at the same time that some molecular building blocks of pre-rRNA are modified by methylases enzymes or by small nucleolar RNA complexes (snoRNPs). The processing and modification of the pre-rRNAs do not occur in naked RNAs, conversely, these reactions take place in pre-ribosomal particles, which are complexes where the ribosomal proteins are assembling hierarchically. The restructuration of the pre-ribosomal particles and its subsequent maturation to ribosomal subunits needs a large number of protein factors, more than 300, which are known as assembly factors or trans-acting factors. These factors are not present in the mature ribosomal particles. One part of these reactions occurs in the nucleoplasm or even in the cytoplasm. The ribosomal synthesis process has not only academic, but also biomedical interest, because a set of hereditary diseases with bad prognostic, called ribosomopathies are associated to loss of function mutation in some ribosomal proteins and/or assembly factors. Moreover, this process has been related with autoimmune pathologies and in a direct manner with large number of cancers and viral infections. The RNA dependent RNA helicases are among the assembly factors that facilitate the biogenesis of ribosomes. In a biochemical sense, these enzymes unwind RNA duplexes using the energy released by ATP hydrolysis. The RNA helicases are classified according to their sequence and structural properties in superfamilies (SF1-SF5). The superfamilies are formed at the same time by several subfamilies. Of special interest for our work are the RNA helicases belonging to the so-called DEAD-box protein subfamily, named as such due to the presence of the amino acids aspartic, glutamic, alanine and aspartic, in this order, in a specific place of its sequences. These amino acids are involved in ATP binding and hydrolysis. The DEAD-box proteins are composed by two structural domains, each one similar to the bacterial RecA protein, that contain a set of highly conserved sequence motifs. These motifs are involved in ATP binding and hydrolysis, nucleic acid binding, duplex unwinding or in the coordination between those reactions. Today, up to 19 helicases from the DEAD-box protein subfamily have been identified to be involved in the biogenesis of cytoplasmic ribosomes. However, the precise role of these enzymes in that process is clearly not fully understood. Therefore, the objective of this work has consisted in the biochemical and functional characterization of two functionally-related helicases during the biogenesis of the 60S ribosomal subunit. These helicases are Dbp7 and Dbp9. Both proteins are necessary for the 60S subunits biogenesis due to their roles during the processing of the early 27SA pre-rRNAs and therefore for the accumulation of the mature 25S and 5.8S rRNAs. However, the exact role of Dbp7 and Dbp9 in this process is still unknown. To accomplish these objectives, we have carried out a functional characterization of Dbp7 protein in vivo. The conserved motifs of this protein, and its two longs N- and C- terminal extensions were identified in the amino acid sequence. In the N-terminal extension, we could identify a putative nuclear localization signal (NLS). Several mutants were constructed for the study. The results of growth analysis and polysome profiles in point mutants in the motifs I and VI, involved in ATP binding and hydrolysis, demonstrated that these motifs play an important role in Dbp7 function, since they showed a delay in growth, possibly due to a decrease in the levels of 60S subunits. Similar results were obtained in mutants with deletions of specific regions in the N- and C- terminal extensions of the protein. The observed defects were not due to a delocalization of Dbp7, since in all the mutants with deletions in the N- and C- extensions, the protein was still associated to hight molecular weight complexes, probably pre-60S ribosomal particles. Moreover, by epifluorescence, we have checked that the putative NLS localized in the N-terminal end of Dbp7 is a bona fide nuclear localization signal. A dbp7 mutant lacking the NLS grew as an isogenic wild-type strain and the protein was able to reach the nucleus; therefore, Dbp7 must contain others redundant NLS not recognizable in a sequence analysis or is imported into the nucleus through binding to another protein that transfers it to that location. It has been demonstrated that Dbp7 is functionally associated to a protein complex called Npa1 complex and it is formed by the proteins Dbp6, Nop8, Rsa3, Npa1 and Npa2. Npa1 binds to specific positions in rRNA in the domains I and VI of rRNA 25S, so it has been proposed that the Npa1 complex is involved in the restructuration of these domains during the early nucleolar maturation of 60S subunits. This process involves the assembly of the ribosomal protein uL3. Dbp7 is genetically associated to this complex. Some snoRNAs participate in these restructuring reactions, among them snR190, whose target sequences of RNA are neighboring the region where Npa1 binds. Npa1 also binds directly to snR190. Our group has been identified mutations in the 25S rRNA that interfere with the binding of snR190 to the rRNA and partially suppress the growth defects of a dbp7 null mutant. In this work, we have generated a double dbp7Δ snR190 mutant strain, whose growth is improved compared to that of a single dbp7Δ mutant. Consistent with this result, snR190, among other snoRNAs, is retained in pre-ribosomal particles in the absence of Dbp7. This phenomenon does not occur in an isogenic wild-type strain. Thus, our work suggests that Dbp7, probably carrying out its function as a RNA helicase enzyme, participates in the releasing of the at least snR190 from the early 60S ribosomal particles in progression to maturation. In the second part of this Thesis work, we have studied the enzymatic characteristic of Dbp7 in vitro, more specifically its possible activities ATPase, binding to RNA and helicase. Making use of colorimetric enzymatic and radioactive assays, we have demonstrated that a recombinant protein of Dbp7 that was expressed and purified from Escherichia coli extracts presents an ATPase activity dependent of RNA and specific DNA oligonucleotides (i.e. poly dT of 30 nucleotides length). Simultaneously, we have demonstrated that Dbp7 binds to RNA and shows helicase activity in vitro. Dbp7 is able to unwind RNA duplexes in 5´-3´and 3´-5 directions. This activity is only dependent of ATP hydrolysis. Likewise, we have studied the previous activities in the Dbp7 point mutants in domains involved in the ATP binding and hydrolysis (Dbp7[K197A] and Dbp7[R553A]). However, surprisingly, both mutants maintain the activities of the wild-type protein. These results are discussed in the context of the functional and structural domains of Dbp7. Finally, in this work, we have started the preliminary characterization of the biochemical activities of the RNA helicase Dbp9. In a similar approach to that done with Dbp7, we have expressed and purified the recombinant Dbp9 protein from E. coli extracts and we have started it biochemical characterization. Our first assays suggest that the recombinant protein has ATPase activity dependent of an DNA oligonucleotide, but it neither has the ability to bind RNA nor helicase activity under the conditions tested.
Actividad de antimicrobianos sobre biocapas bacterianas en biomateriales plásticos
(1992-10-01) Ramírez de Arellano Ramos, Encarnación; Perea Pérez, Evelio José; Pascual Hernández, Álvaro; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
Alteración cromática de monumentos tras la limpieza con láser: origen, naturaleza y eliminación del amarilleamiento de las piedras
(2004-03-25) Gaviño Troncoso, María; Hermosín Campos, Bernardo; Sáiz Jiménez, Cesáreo; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
Identificación y estudio de genes simbióticos de Sinorhizobium fredii HH103 previamente no caracterizados
(2020-09-25) Navarro Gómez, Pilar; Vinardell González, José María; Acosta Jurado, Sebastián; Universidad de Sevilla. Departamento de Microbiología
En la relación simbiótica que tiene lugar entre plantas leguminosas y rizobios fijadores de nitrógeno es necesaria una comunicación recíproca entre ambos organismos en la que intervienen señales químicas producidas por la planta y la bacteria. Sinorhizobium fredii HH103 es un rizobio simbionte de la soja que presenta un amplio rango de hospedador (Margaret et al., 2011; Vinardell et al., 2015). Los flavonoides exudados por la raíz de la leguminosa inducen la expresión de los genes simbióticos rizobianos a través de la activación de la proteína bacteriana NodD. La proteína reguladora NodD se expresa constitutivamente y codifica un activador transcripcional de tipo LysR que, en presencia de flavonoides específicos, reconoce y se une a nod boxes (NB), secuencias promotoras localizadas aguas arriba de los genes de nodulación, desencadenando su transcripción. Las NB controlan la expresión de genes involucrados en la producción de señales moleculares (factores Nod) necesarias para los pasos iniciales de la interacción simbiótica, así como para la transcripción del gen ttsI, cuyo producto va a reconocer y unirse a tts boxes (TB), induciendo la secreción de proteínas (efectores) a través del sistema de secreción de tipo 3 (T3SS). Estas proteínas efectoras modulan la respuesta defensiva de la planta y son importantes para determinar la compatibilidad entre ambos simbiontes. También hay varios genes de HH103 con función desconocida y cuya expresión es dependiente de NB. Además, hay grupos de genes en HH103 que se expresan diferencialmente en presencia de genisteína (flavonoide inductor de los genes de nodulación en HH103) pero que no están controlados por una NB o una TB (Pérez-Montaño et al., 2016b). Actualmente, muchos de estos genes de S. fredii HH103 ya han sido estudiados. Sin embargo, todavía hay genes simbióticos importantes que continúan sin ser caracterizados. El estudio de algunos de estos genes ha sido uno de los objetivos principales de esta Tesis para profundizar en su posible papel simbiótico y aumentar el conocimiento sobre los determinantes moleculares que permiten que esta bacteria establezca simbiosis con un elevado número de leguminosas. Más específicamente, hemos estudiado los siguientes genes: - psfHH103d_448 y psfHH103d_208 cuya expresión es controlada por la NB13 y 17, respectivamente (objetivo 1). El gen psfHH103d_448 codifica una proteína hipotética no presente en otros rizobios, incluso en otras estirpes de S. fredii. Contiene un dominio receptor, lo que sugiere su pertenencia a un sistema de dos componentes, en el que participan una proteína histidina quinasa (HK) y una proteína reguladora de respuesta (RR). La HK, regulada por un estímulo ambiental, se autofosforila en un residuo de histidina creando un grupo fosforilo altamente energético que es transferido a un residuo de aspartato en la RR. La fosforilación de esta proteína induce un cambio conformacional en su dominio regulador lo que resulta en la activación de su dominio efector desencadenando así una respuesta (Stock et al., 2000). El producto de psfHH103d_448 podría ser el componente RR, pero carece de dominio conocido de unión a ADN. El gen psfHH103d_208 codifica una proteína con un dominio conservado denominado casete de unión a ATP, lo que indica que es miembro de la familia de transportadores de tipo ABC (del inglés, ATP-binding cassette). Esta familia de transportadores comprende una superfamilia grande y diversa de transportadores de membrana que están presentes en todos los dominios de la vida. En bacterias, catalizan reacciones de transporte. Por ejemplo, la absorción de micronutrientes de alta afinidad y la exportación de compuestos citotóxicos (contribuyendo a la resistencia de la bacteria a medicamentos) (Locher, 2016). En esta Tesis hemos visto que la inactivación de cualquiera de estos dos genes no tiene efecto en la eficiencia simbiótica de HH103 con soja. - Cinco genes localizados en el plásmido simbiótico y regulados por la NB1 (objetivo 2). Esta caja controla la expresión de psfHH103d_373 a psfHH103d_370, los cuales podrían estar implicados en síntesis de triterpenoides pentacíclicos llamados hopanoides. La inactivación de sus genes ortólogos en Bradyrhizobium sp. y Bradyrhizobium diazoefficiens afecta negativamente a la supervivencia bacteriana en condiciones de estrés y a su capacidad simbiótica con sus leguminosas hospedadoras. El hecho de que en S. fredii HH103 estos genes se induzcan por flavonoides y NodD1 sugirió que los hopanoides podrían ejercer un papel protector durante la simbiosis. Sin embargo, en esta Tesis hemos visto que HH103 no produce hopanoides en presencia de flavonoides y que la inactivación de varios de estos genes tiene poco efecto en la simbiosis con soja. - Un posible operón localizado en el cromosoma y constituido por flgJ (codifica una proteína flagelar) y dos genes que codifican proteínas hipotéticas conservadas, SFHH103_00347 y SFHH103_00348 (objetivo 3). En esta Tesis hemos visto que la expresión de estos genes es dependiente de NodD1 y TtsI a través de una TB imperfecta localizada aguas arriba de flgJ, pero que su expresión también se ve ligeramente influenciada por SyrM debido a la presencia de una SyrM box (SB) también imperfecta. La inactivación de cualquiera de estos genes suprime totalmente la movilidad de tipo swimming, y en el caso de SFHH103_00347 y SFHH103_00348, también la movilidad en superficie, la cual es dependiente de genisteína en HH103. Los mutantes en flgJ y en SFHH103_00347 carecen de flagelo. La inactivación de flgJ disminuye parcialmente la movilidad en superficie indicando que, además del swarming, otros mecanismos son responsables de este tipo de movilidad. En simbiosis, la inactivación de estos genes tiene distintos efectos en función del gen mutado y de la leguminosa hospedadora estudiada. Finalmente, en trabajos previos, nuestro grupo mostró que la proteína NodD1 es el regulador principal en presencia de genisteína de la expresión génica de HH103, pero otros genes reguladores tienen un papel en la modulación de la expresión del regulón nod. El segundo objetivo principal de esta Tesis (objetivo 4) ha sido continuar con la caracterización del complejo circuito regulador que depende de flavonoides en S. fredii HH103. Para este propósito, hemos integrado los datos de RNAseq de mutantes de HH103 afectados en diferentes reguladores transcripcionales, y hemos usado métodos alternativos (qPCR, ensayos β-galactosidasa) para analizar la expresión de esos reguladores en distintas condiciones (presencia o ausencia de flavonoides, presencia o ausencia de otros reguladores). Hemos visto la importancia de los reguladores transcripcionales TtsI, NodD2, NolR y SyrM como “elementos secundarios” del regulón nod, conduciendo a un fine tuning de diferentes características bacterianas involucradas en la transición de vida libre al estado simbiótico: factores Nod y producción de exopolisacáridos, liberación de proteínas efectoras a través del T3SS simbiótico, movilidad en superficie.

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