Clonación y regulación de las enzimas del complejo cisteína sintasa de Chlamydomonas reinhardtii

Abstract

CONCLUSIONES: 1. Se ha aislado y caracterizado un cDNA de 1992 pb de longitud, denominado Sat1ACr, que codifica una de las isoformas SAT de Chlomydomonas reinhardtii. Sat1ACr presenta una alta homología con las proteínas de plantas, indicando que la enzima de Chlomydomonas reinhardtii es estructuralmente más similar a las SAT eucarióticas que a la enzima procariótica. Los residuos de aminoácidos implicados en la inhibición por L-cisteína de las SAT citosólicas de plantas no están conservados en Sat1ACr. 2. También se ha aislado y caracterizado un cDNA, Cys1ACr de 1492 pb de longitud, que codifica una isoforma OASTL de Chlomydomonas reinhardtii. Cys1ACr presenta en la región amino-terminal un posible péptido señal que sugiere una localización cloroplástica. El alineamiento de la secuencia deducida de aminoácidos de Cys1ACr con otras OASTL, así como la existencia de reacción inmunológica cruzada con A. thaliana, sugiere una mayor similitud con las isoformas organulares de plantas superiores que con la enzima procariótica. Además, presenta el dominio conservado SVKDR, donde se localiza el residuo de lisina implicado en la unión al piridoxal-5’-fosfato. 3. Por vez primera se ha determinado la actividad SAT en extractos crudos de Chlomydomonas reinhardtii, siendo su proporción con respecto a la actividad OASTL de 1:160. Se ha estudiado el efecto de la nutrición de nitrógeno y azufre sobre ambas actividades, observándose una fuerte activación en condiciones de limitación de azufre. Esta activación requiere de la presencia de fuente de nitrógeno en el medio de cultivo para que sea máxima. Estos resultados ponen de manifiesto la co-regulación existente entre los componentes del complejo Cisteína sintasa por el estado nutricional de Chlomydomonas reinhardtii. 4. Se han analizado los niveles de expresión génica de Sat1ACr y Cys1ACr en diferentes condiciones nutricionales. Ambos transcritos se induce por carencia de azufre, pero la respuesta es más lenta y menor que la observada a nivel de actividad. Este hecho puede ser debido a que otras isoformas SAT y OASTL del alga sean las responsables del incremento de actividad, o bien a que la regulación de Sat1ACr y Cys1ACr por limitación de azufre se produzca a nivel post-transcripcional. 5. Se han obtenido anticuerpos policlonales frente a Cys1ACr recombinante de Chlomydomonas reinhardtii. Estos anticuerpos son capaces de reconocer dos isoformas OASTL, Cys1ACr y una proteína de 34 kDa en extractos crudos del alga. Estudios de inmunodetección de estas isoenzimas en células crecidas en diferentes condiciones nutricionales, han puesto de manifiesto una respuesta diferenciada de las mismas a la limitación de azufre, presentando Cys1ACr una respuesta más rápida. 6. También hemos analizado los niveles de actividad, expresión génica SatACr y Cys1ACr y nivel de proteína OASTL en los mutantes sac1 y sac3 de Chlomydomonas reinhardtii, afectados en la aclimatación a la limitación de azufre. Sac1 presenta una respuesta anormal a la carencia de azufre, no induciéndose ni SAT ni OASTL en ninguno de los niveles estudiados. Sac3 presenta un patrón de regulación similar a la estirpe silvestre, induciéndose los niveles de actividad y expresión de ambas enzimas, pero con diferencias apreciables a nivel de proteína. Mientras la proteína 34 kDa se regula por limitación d azufre de manera similar en sac3 y en la estirpe silvestre Cys1ACr presenta un modelo de regulación diferente.