dc.description.abstract | En esta tesis se han estudiado las adsorciones y co-adsorciones de las bases
complementarias del ADN, así como las interacciones entre ellas, en las interfases
organizadas de electrodos monocristalinos de oro o de películas de oro nanoestructuradas.
Se ha utilizado para ello una metodología que combina técnicas de tipo puramente
electroquímico, tales como los de voltametría cíclica, coulombimetría y espectroscopia
electroquímica de impedancias (EIS, por sus siglas en inglés) con diversas técnicas
espectro-electroquímicas por transformada de Fourier en el infrarrojo (FT-IR) “in-situ” .
En concreto, se han utilizado las técnicas de absorción-reflexión en el infrarrojo en las
configuraciones de reflexión externa (SNIFTIRS, por sus siglas en inglés) y (PM-IRRAS,
por sus siglas en inglés) e interna (ATR-SEIRAS, por siglas en inglés), utilizando las
correspondientes células espectro-electroquímicas que permiten la aplicación y variación
de potenciales eléctricos a los electrodos de oro, de manera simultánea al experimento
FT-IR.
Los estudios de adsorción de las bases del ADN sobre electrodos metálicos son
interesantes debido a la relevancia biológica de las mismas y las analogías de sus
organizaciones en las interfases electródicas con las organizaciones en las membranas
biológicas. Las técnicas que se han utilizado proporcionan una información estructural a
escala microscópica interesante en función del campo eléctrico en las interfases. Por otra
parte, los estudios tienen interés aplicado en relación con el diseño de biosensores o de
plataformas de liberación de medicamentos.
Los sistemas a estudiar se han seleccionado con dos grados de aproximación a las
interfases biológicas. Así, en la primera parte (parte I de la tesis) se han estudiado las
adsorciones de las cuatro bases del ADN y las co-adsorciones de los dos pares de bases
complementarias sobre electrodos monocristalinos y sobre películas nanoestructuradas
de oro en función del potencial. En la segunda parte (parte II), se ha realizado una
aproximación mayor a las interfaces biológicas mediante el estudio de monocapas y
bicapas de compuestos que contienen tanto cadenas alifáticas como alguna de las bases
del ADN. En concreto, se han preparado estructuras organizadas del nucleolípido 1,2-
dipalmitoil-sn-glicero-3-citidina, que contiene la base citosina, sobre electrodos Au(111).
Se han caracterizado dichas estructuras y se han estudiado sus posibilidades de
reconocimiento molecular en relación con la base complementaria guanina.
La tesis se ha estructurado en 7 capítulo. El capítulo 1 consiste en una introducción
general de la tesis que contiene los objetivo, los antecedentes acerca de de la adsorciones
y co-adsorciones de las bases del ADN, de sus propiedades ácido bases y de los
equilibrios tautoméricos en los que participan. Incluye también la descripción de la
estructura de la tesis. El capítulo 2 está dedicado a la metodología utilizada en la tesis y
en él se describen los fundamentos teóricos y técnicos de las metodologías
electroquímicas y espectro-electroquímicas FT-IR.
En el capítulo 3 se presentan los estudios de las adsorciones y co-adsorciones de las bases
complementarias adenina y timina. El grupo de investigación realizó previamente el
estudio de la adsorción de la adenina en algunas condiciones experimentales, pero en esta
tesis se han extendido los estudios acerca de los equilibrios ácido-base, mediante el
estudio de las adsorciones de las dos especies que participan en el segundo pKa de la
adenina. Se ha podido caracterizar mediante ATR-SEIRAS la adsorción de la forma
aniónica de la adenina y determinar el valor del pKa2 en la interfase. El valor encontrado
es muy próximo al de la adenina en disolución lo que confirma el modelo de adsorción
previamente propuesto por el grupo de investigación en el que los sitios de interacción de
la molécula con el electrodo no incluyen la participación del nitrógeno (N9) que
experimenta la desprotonación en el segundo equilibrio ácido-base.
En cuanto a los estudios de la adsorción de la timina en el rango de pH 1 a 12 se ha podido
determinar la estabilidad de los diferentes tautómeros de la timina. Los espectros de
ATR-SEIRA muestran que, independientemente del valor del pH, la interacción con la
superficie nanoestructurada de oro se produce por los tautómeros desprotonados de la
timina. En base a cálculos DFT, se comprueba que en medio ácido se adsorbe sobre oro
el tautómero desprotonado en N3, mientras en el medio básico lo hace el tautómero
desprotonado en N1. Además, la deconvolución de las señales obtenidas en el espectro de
ATR-SEIRA a pH neutro pone de manifiesto que ambos tautómeros coexisten a pH 7. A
partir de la deconvolución y determinación de intensidades de las señales
correspondientes a los modos normales de vibración de tensión de CH y CH3 de la
molécula de timina se propone un modelo de adsorción para los diferentes tautómeros y
los cambios que sus orientaciones con el potencial eléctrico. Así, a pH ácido,se ha propuesto que el tautómero desprotonado en N3 interacciona a potenciales bajos mediante
el grupo carbonilo C2O y reorienta su plano molecular al aumentar el potencial para
permitir la interacción con la superficie del electrodo también por el nitrógeno N3 y el
carbonilo C4O. A valores de pH básicos se ha propuesto que la interacción del tautómero
desprotonado en N1 con el electrodo implica los grupos N1 y C2O en todo el rango de
potenciales.
Por último, en el capítulo 3 se ha abordado la co-adsorción de las bases complementarias
timina y adenina sobre superficies nanoestructuradas de Au a diferentes valores de pH.
Los resultados de ATR-SEIRAS muestran que el cambio de intensidad en las señales de
adenina y timina puede estar provocado por variaciones en la organización molecular
sobre el electrodo de Au. Estas variaciones implican un aumento en el ángulo de
inclinación molecular respecto al electrodo para el caso de la adenina y una disposición
paralela al electrodo para el caso de la timina. El alto límite de detección de la
metodología ATR-SEIRAS ha permitido comprobar que el efecto de la presencia de las
dos bases complementaria parece ser cooperativo y se detecta incluso con muy bajas
concentraciones de adenina.
En el capítulo 4 se presenta el estudio mediante EIS de la cinética de adsorción de la
adenina sobre electrodos Au(111) en medios de pH ácido, neutro y básico. Se ha
pretendido de esta forma caracterizar la cinética de adsorción de las tres formas de la
adenina que existen en los tres medios. El grupo de investigación había aplicado
previamente esta metodología electroquímica a la adsorción de la forma neutra de la
adenina, pero en vista de los resultados espectro-electroquímicos en medio ácido que
indican la desprotonación previa a la adsorción de la forma catiónica, se ha extendido el
análisis a un rango más amplio de valores de pH. Ha sido preciso para ello desarrollar la
teoría que permite deducir las ecuaciones de impedancia para el modelo de adsorción que
incluye una etapa de desprotonación previa a la adsorción. Las nuevas ecuaciones de
impedancia implican una dependencia de la impedancia con la frecuencia de la
perturbación de alterna de la técnica distinta de la que cabe esperar para un modelo simple
de adsorción que solo está controlado por la difusión del adsorbato y/o por la activación
del proceso de adsorción química. Sin embargo, se distinguen casos límites (de alta y de
baja frecuencia) en los que la dependencia con la frecuencia de la impedancia del modelo
que incluye la etapa química es idéntica a la del modelo de adsorción simple. En base a
dichas ecuaciones se propone el análisis de los datos experimentales en función de la frecuencia y se determinan los parámetros característicos de la cinética de la adsorción en
función del potencial eléctrico. Del análisis de dichos parámetros se ha podido determinar
en medios ácidos la constante de equilibrio para la desprotonación de la adenina, y las
variaciones de la función que incluye las constantes de velocidad de la adsorcióncon el
potencial, en los tres medios considerados.
El capítulo 5 explora la adsorción y co-adsorciones de guanina y citosina sobre electrodos
de oro a tres valores de pH que comprenden medios ácidos, neutros y básicos, con objeto
de estudiar las adsorciones de las especies con distinto grado de protonación de las bases
y de establecer el rango de potenciales en los que las dos bases pueden adsorberse
simultáneamente. Sin embargo, no se ha sobrepasado el segundo pKa por ser demasiado
alto y afectar la estabilidad de las nanoestructura del electrodo de oro. La comparación de
los espectros de ATR-SEIRA para la citosina con los correspondientes espectros de
transmisión en la región de 1300-1800 cm-1 ha permitido decidir que la forma neutra de
la citosina se adsorbe en todos medios. Ello implica que en medio ácido la adsorción debe
incluir una etapa de desprotonación previa. El análisis de detallado de las intensidades
integradas de las señales de los espectros de ATR-SEIRAS ha permitido detectar que en
medios neutros o ligeramente básicos y a bajos potenciales se adsorben dos especies
distintas de citosona, lo que sugiere la posibilidad de tautómeros distintos. Los cálculos
mediante DFT de los espectros de las moléculas aisladas y de las moléculas adsorbidas
sobre clústeres de oro de los distintos tautómeros ha permitido asignar las señales de los
espectros FT-IR y proponer el tautómero más estable en estado adsorbido así como el
modelo de adsorción.
Los estudios espectro-electroquímicos similares para la guanina realizados a los mismos
valores de pH que los de la citosina han permitido concluir que en medios neutros y ácidos
se adsorbe la guanina neutra mientras que en medios fuertemente básicos lo hace la forma
aniónica y proponer las orientaciones moleculares de dichas formas sobre el electrodo,
así como los sitios de interacción con el mismo en cada caso.
En los estudio de las co-adsorciones de las bases sitosina y guanina se han observado
efectos muy parecidos a los ya comentados para el caso de las co-adsorciones adeninatimina,
que se han atribuido de igual forma a una orientación más paralela de la citosina
y más perpendicular de la guanina respecto a la superficie electródica. El capítulo 6 corresponde a la segunda parte de la tesis y en el mismo se presenta la
preparación, caracterización electroquímica y espectro-electroquímica de monocapas y
bicapas de Langmuir en las que participa el nucleolípido 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-
citidina (que contiene la base citosina), adsorbidas sobre electrodos de oro Au(111). En
estos casos ha resultado particularmente interesante la utilización de la modalidad PMIRRAS
de la espectroscopia FT-IR. Los estudios comprende las estructuras que se
obtienen tanto en ausencia como en presencia de la guanina. Las asignaciones de las
señales ha sido posible por comparación con los espectros de transmisión del nucleolípido
y de la citosina así como de los de ATR-SEIRA de las bases adsorbidas. Los resultados
indican que la monocapa se une a la superficie del electrodo a través del grupo citosina.
La presencia de guanina en el medio induce la adsorción de la misma sobre el electrodo
que induce una reorientación de la citosina hacia una disposición más plana respecto a la
superficie el electrodo, como en el caso de las co-adsorciones guanina citosina. El cálculo
de los ángulos de inclinación de la cadena carbonada respecto a la superficie del electrodo
sobre la base de las intensidades de las señales de los modos característicos de vibración
de dichas cadenas, permite decidir acerca del grado de organización de las monocapas.
Se han preparado bicapas que expongan la parte hidrofílica del nucleolípido, que incluye
la citosina, hacia la disolución mediante el uso de un derivado tiólico de cadena alifática
similar a la del nucleolípido. Dichas bicapas se han caracterizado de manera similar al
caso de las monocapas. Los resultados de PM- IRRAS han permitido decidir acerca de la
organización tanto en ausencia como en presencia de guanina y se han alcanzado
conclusiones de interés con vistas a las posibilidades del uso de las mismas con fines de
reconocimiento molecular.
Finalmente, en el capítulo 7 se recogen las conclusiones más relevantes de esta tesis. | es |