Factores bioquímicos implicados en la degradación oxidativa de compuestos fenólicos durante el proceso de obtención del aceite de oliva virgen

Abstract

La producción de aceites de oliva virgen (AOV) de mayor calidad, muy aromáticos y con notas amargas y picantes, de intensidad moderada, bien equilibrada es una prioridad tanto en la selección de variedades como en el desarrollo de procesos tecnológicos. Los compuestos secoiridoideos, entre los que se incluyen derivados de las agluconas de la oleuropeína, demetiloleuropeína y ligustrósido, son los derivados fenólicos más abundantes en el AOV (Servilli y Montedoro, 2002; Servili et al., 2004). La composición fenólica del AOV depende en buena medida de la variedad de olivo, aunque existen diversos factores como técnicas de cultivo, recolección, conservación y procesado de la aceituna que pueden modificarla (Artajo et al., 2006; Servilli et al., 2004). El efecto de estos factores sobre el perfil fenólico del aceite parece estar estrechamente relacionado con la modificación del nivel de actividad de diferentes enzimas endógenas presentes en el fruto (García et al., 2001; Servili et al., 2007). Durante el proceso de obtención del AOV, por acción de glucosidasas presentes en la aceituna, los principales glucósidos fenólicos son hidrolizados para dar lugar a derivados parcialmente solubles en el aceite, entre los que se encuentran las formas aldehídicas y dialdehídicas de la aglucona de la oleuropeína (AAO y DAOD) y del ligustrósido (AAL y DALD), que por posterior hidrólisis dan lugar a tirosol e hidroxitirosol. En proyectos anteriores se ha aislado y purificado a aparente homogeneidad, una proteína con actividad ß-glucosidasa en pulpa de aceituna que exhibe una potente actividad frente al principal glucósido fenólico de la aceituna, la oleuropeína. Sin embargo, los estudios preliminares sobre las cinéticas de formación y degradación de compuestos fenólicos durante el proceso de obtención del AOV señalan la importancia no sólo de las enzimas implicadas en la formación de compuestos secoiridoideos, como la ß-glucosidasa, sino también el importante papel que juegan las enzimas óxido-reductasas de la aceituna en la degradación de estos compuestos durante el procesado, restringiendo su incorporación al aceite. En este sentido, es de destacar la importante carga de actividad peroxidasa (POX), con demostrada actividad frente a los compuestos fenólicos más característicos del AOV, asociada a la semilla de aceituna (Luaces et al., 2007). Es importante señalar que la existencia de esta actividad POX en semilla de aceituna no permite descartar la contribución de otras óxido-rreductasas como la polifenol oxidasa (PPO) y la lipoxigenasa (LOX) en la degradación de fenoles que tiene lugar durante el proceso de extracción del AOV. El trabajo de investigación de esta Tesis Doctoral se enmarca dentro de una hipótesis de trabajo general: sólo a través de un adecuado conocimiento de las características cinéticas y de los mecanismos de regulación de los genes/enzimas relacionados con el desarrollo de una determinada característica del AOV podrían establecerse estrategias de control, tanto en el ámbito puramente tecnológico como en programas de mejora varietal, que permitan optimizar esa característica en particular. En una primera fase podrían desarrollarse nuevos aceites de oliva con características específicas mediante la modulación de los correspondientes procesos bioquímicos activos durante la elaboración de los mismos. Posteriormente y, mediante la caracterización de los sistemas enzimáticos más relacionados con la calidad final del aceite y de los genes que los codifican, podrían seleccionarse clones de olivo con características organolépticas, nutricionales o tecnológicas mejoradas mediante la obtención de marcadores moleculares.

Se ha evaluado la participación de distintas óxido-reductasas endógenas en la degradación oxidativa de compuestos fenólicos producida durante el proceso de extracción del AOV, concluyéndose que sólo las enzimas POX y PPO contribuyen de manera significativa a dicha oxidación. Se han desarrollado protocolos de extracción y medida actividad enzimática adecuados para las proteínas con dicha actividad en aceituna. Ambas actividades enzimáticas se han determinado utilizado paralelamente tanto métodos espectrofotométricos con sustratos estándar como métodos específicos de análisis por HPLC que han permitido por primera vez cuantificar la degradación oxidativa catalizada por POX y PPO de aceituna frente a sus sustratos naturales en olivo: los compuestos fenólicos de la aceituna y el AOV. Se han medido los niveles de actividad POX y PPO en distintas partes del fruto, determinándose que la POX se localiza mayoritariamente en semilla y la PPO en la pulpa de la aceituna. Ambos materiales han sido analizados en frutos de distintos grados de maduración de las variedades Arbequina y Picual, así como durante todo el proceso de obtención del AOV (molturación del fruto y batido de la pasta de aceituna). Para determinar cuáles pueden ser los factores limitantes de dichas reacciones de oxidación, se modificaron las cargas enzimáticas de POX y PPO mediante la adición durante el procesado del fruto de enzimas análogas disponibles comercialmente y/o mediante el empleo de inhibidores específicos de cada una de ellas. En los ensayos de modulación de POX se realizaron ensayos con adiciones de POX comercial de rábano y semillas de aceituna, así como cofactores como el peróxido de hidrógeno e inhibidores como la azida sódica. En el caso de la modulación de actividad PPO, se llevaron a cabo adiciones de polvos acetónicos de pulpa ricos en PPO y tropolona como inhibidor específico de la enzima. En todos estos ensayos tecnológicos se evaluó la modificación del perfil fenólico de los aceites mediante análisis HPLC (Luaces et al., 2007). Para profundizar en el papel que juega la POX de semilla en la determinación del perfil fenólico del AOV, se ha llevado a cabo un proceso de purificación de las proteínas con actividad POX de semilla de aceituna. El protocolo de purificación empleado, que incluye un fraccionamiento con sulfato amónico y varias cromatografías de intercambio aniónico y catiónico en FPLC, ha permitido la purificación a homogeneidad de dos isoenzimas de naturaleza aniónica y catiónica. Ambas isoformas de POX de aceituna han sido caracterizadas en profundidad evaluándose su especificidad frente a los principales glucósidos fenólicos de la aceituna y los compuestos secoiridoideos del AOV, así como su estabilidad térmica y el efecto de diversos inhibidores.