Repositorio de producción científica de la Universidad de Sevilla

Role of glucoside transporters in the biology of the heterocyst-forming cyanobacterium anabaena SP.

 

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dc.contributor.advisor Flores García, Enrique es
dc.creator Nieves Morión, Mercedes es
dc.date.accessioned 2018-03-09T13:06:19Z
dc.date.available 2018-03-09T13:06:19Z
dc.date.issued 2018-02-23
dc.identifier.citation Nieves Morión, M. (2018). Role of glucoside transporters in the biology of the heterocyst-forming cyanobacterium anabaena SP.. (Tesis Doctoral Inédita). Universidad de Sevilla, Sevilla.
dc.identifier.uri https://hdl.handle.net/11441/70894
dc.description.abstract La aparición de organismos multicelulares supuso una de las mayores transiciones durante el curso de la evolución biológica temprana, habiendo surgido la multicelularidad de manera independiente en los tres dominios de la vida. Las cianobacterias son un amplio grupo monofilético de procariotas fotosintéticos con representantes unicelulares y multicelulares. Muchas cianobacterias filamentosas experimentan procesos de diferenciación celular dando lugar a células o grupos de células con funciones especializadas como son la fijación de nitrógeno, la supervivencia a condiciones adversas y la dispersión. La cianobacteria formadora de heterocistos Anabaena sp. PCC 7120 representa un sistema modelo para estudiar la multicelularidad, la diferenciación cellular y la fijación de nitrógeno. Anabaena crece formando cadenas de células, conocidas como tricomas o filamentos. En ausencia de una fuente de nitrógeno combinado, estos filamentos están formados por dos tipos celulares: células vegetativas que llevan a cabo la fotosíntesis oxigénica y heterocistos que fijan el nitrogeno atmosférico. Las células vegetativas transfieren carbono reducido a los heterocistos, y éstos transfieren nitrógeno a las células vegetativas. La transferencia intercelular de diferentes compuestos es un aspecto muy relevante de la biología de Anabaena que ha sido abordado en esta tesis. Dos vías distintas han sido consideradas para explicar la transferencia de nutrientes y reguladores entre las células del filamento durante la diferenciación de los heterocistos y el crecimiento diazotrófico en estas cianobacterias: una vía indirecta a través del periplasma del filamento y una directa a través de los complejos proteicos llamados “nexos septales” (“septal junctions”). La transferencia molecular intercelular en las cianobacterias filamentosas se ha estudiado con la técnica de análisis Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) usando diferentes marcadores fluorescentes: calceína, 5- carboxifluoresceína (5-CF) y esculina, que es un análogo a la sacarosa. En el Capítulo 1, analizamos la dependencia de la temperatura de la transferencia intercelular y concluimos que presenta propiedades de difusión simple. Esta observación es consistente con la presencia de nexos septales responsables de la comunicación intercelular. SepJ, FraC y FraD son proteínas septales identificadas como posibles componentes de los nexos septales, los cuales concluimos que permiten la transferencia intercelular de sustancias por difusión simple. Los nexos septales pueden ser considerados análogos a los conexones de las “gap junctions” de metazoos. Como ha sido mencionado anteriormente, la esculina (análogo fluorescente e la sacarosa) se ha usado para estudiar la transferencia molecular intercelular. En el “Experimental Preamble”, describimos un ensayo que puede ser usado para estudiar la incorporación de esculina a las células de Anabaena. Con este ensayo hemos definido que los transportadores que incorporan esculina en Anabaena son transportadores de α-glucósidos, ya que la incorporación de esculina es inhibida por α- glucósidos como la sacarosa y la maltosa. Los Capítulos 2 y 3 describen la identificación de componentes de transportadores de glucósidos del tipo ABC. Estos componentes son GlsC y GlsD (“nucleotide-binding domain proteins” [NBDs]), GlsP and GlsQ (“transmembrane domain proteins” [TMDs]), y GlsR (“solute-binding protein” [SBP]). Además, HepP, una proteína de la familia MFS, previamente descrita, también contribuye a la incorporación de esculina especialmente en condiciones diazotróficas. Anabaena ha sido considerada un organismo fototrófico estricto durante mucho tiempo. Sin embargo, aunque esta cianobacteria no tiene ningún gen que codifique de forma evidente un transportador de fructosa, trabajos recientes han indicado que puede crecer heterotróficamente con una concentración relativamente alta de fructosa (≥ 50 mM). En el Capítulo 3, describimos el crecimiento fototrófico estimulado por sacarosa, fructosa y glucosa en Anabaena, mostrando la capacidad de crecimiento mixotrófico de este organismo usando estos azúcares. Con objeto de averiguar si los componentes de los transportadores de glucósidos del tipo ABC que hemos identificado están relacionados con el crecimiento estimulado por azúcares, estudiamos el crecimiento mixotrófico en sus mutantes. Mientras que los mutantes glsC y glsD estaban drásticamente afectados en el crecimiento estimulado por sacarosa, los mutantes glsP, glsQ y glsR estaban afectados a menor nivel. Todos los mutantes también estaban afectados de alguna manera en el crecimiento estimulado por fructosa y glucosa, lo cual sugiere que estos azúcares pueden ser asimilados al menos en parte con el concurso de los transportador(es) de glucósidos. El genoma de Anabaena contiene 12 genes que codifican componentes de transportadores de glucósidos tipo ABC: cuatro SBPs, seis TMDs and dos NBDs. Esta información junto con nuestros resultados sugieren la presencia de al menos tres transportadores de glucósidos en Anabaena, uno de los cuales estaría formado por GlsR (SBP), GlsPGlsQ (TMDs) y GlsC-GlsD (NBDs). Otras SBPs podrían contribuir al funcionamiento de este transportador, y las proteínas NBD (GlsC y GlsD) parecen ser compartidas por los tres transportadores como ocurre en otros sistemas ABC. El análisis llevado a cabo mediante Bacterial Adenylate Cyclase Two Hybrid (BACTH) ha mostrado interacciones proteína-proteína consistentes con el modelo propuesto. El efecto de la inactivación de algunos de los genes gls en el crecimiento diazotrófico de Anabaena sugirió la posibilidad de una limitada transferencia de sacarosa a los heterocistos en algunos de estos mutantes. Los mutantes glsC, glsP y hepP estaban afectados en la transferencia intercelular de esculina, por lo que extendimos el estudio a la transferencia de calceína y 5-CF en todos los mutantes gls, así como al mutante hepP. Todos los mutantes ensayados estaban afectados, en particular, en la transferencia intercelular de calceína, lo cual recuerda al fenotipo de la mutación sepJ. Como ya hemos mencionado, SepJ es un posible componente de los nexos septales, y en este trabajo, mediante análisis BACTH, hemos visto que GlsP, GlsQ y HepP interaccionan con SepJ, lo cual sugiere que GlsP, GlsQ and HepP interaccionen con SepJ para un correcto funcionamiento de los nexos septales. Por otro lado, GlsC influye en la localización de SepJ y en el número de nanoporos formados en los discos septales de peptidoglicano. Estos resultados sugieren un papel específico de GlsC influyendo en la maduración de los nexos septales. En conclusión, la cianobacteria formadora de heterocistos Anabaena sp. PCC 7120 expresa transportadores ABC de glucósidos que contribuyen a la asimilación de azúcares haciendo posible un crecimiento mixotrófico. Además, los transportadores de glucósidos estudiados influyen en la comunicación intercelular mediada por los nexos septales. es
dc.description.abstract The appearance of multicellular organisms is considered one of the major transitions during the course of early evolution, and multicellularity has been invented independently several times in all three domains of life. The cyanobacteria are a large group of oxygenic photosynthetic prokaryotes that represents a phylum with unicellular and multicellular (filamentous) forms. In many filamentous cyanobacteria, some cells can differentiate into specialized cells or groups of cells supporting different specialized functions, such as nitrogen fixation, survival and dispersion. The heterocyst-forming cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 represents a model organism to study multicellularity, cellular differentiation and N2 fixation. Anabaena grows as chain of cells, termed trichomes or filaments, which under nitrogen deficiency contain two types of cells: vegetative cells that perform oxygenic photosynthesis and heterocysts that fix nitrogen gas. Vegetative cells transfer reduced carbon to heterocysts, which transfer fixed nitrogen to the vegetative cells. Intercellular molecular exchange is a very relevant aspect of the biology of Anabaena that has been addressed in this thesis. Two different pathways have been considered toxplain the transfer of nutrients and regulators between the cells during heterocyst differentiation and diazotrophic growth in heterocyst-forming cyanobacteria: an indirect pathway via the continuous periplasm of the filament and a direct pathway via septal junction complexes. Intercellular molecular exchange in filamentous cyanobacteria has been studied using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis with different fluorescent markers: calcein, 5-carboxyfluorescein (5-CF) and the sucrose analog esculin. In Chapter 1, we analyzed the temperature-dependence of intercellular molecular exchange and found that it has properties of simple diffusion. This observation favors a direct pathway for intercellular communication. SepJ, FraC and FraD are septal proteins that have been proposed to be components of septal junction complexes. Septal junctions allow intercellular molecular exchange by simple diffusion and appear to be structures analogous to the connexons of the gap junctions of metazoans. As mentioned above, the fluorescent sucrose analog esculin has been used to study intercellular molecular exchange. In the Experimental Preamble, we describe a specific assay that can be used to study the uptake of esculin into Anabaena. Using this assay, we could define that the transporters that mediate esculin uptake in Anabaena are α-glucoside transporters, since esculin uptake is inhibited by the α- glucosides sucrose and maltose. Chapter 2 and 3 describe the identification of components of ABC-type glucoside transporters. These components are GlsC and GlsD (nucleotide-binding domain proteins; NBDs), GlsP and GlsQ (transmembrane domain proteins; TMDs), and GlsR (a periplasmic solute-binding protein; SBP). Additionally, we found that HepP, a previously described Major Facilitator Superfamily (MFS) protein involved in the formation of the heterocyst-specific polysaccharide layer, also contributes to esculin uptake specifically in diazotrophic conditions. Anabaena has been considered as a strict photoautotroph for a long time. Recent work has indicated however that Anabaena can grow heterotrophically with relatively high concentrations of fructose (≥ 50 mM), although this cyanobacterium does not have any gene predicted to encode a fructose-specific transporter. In Chapter 3, we describe sucrose-, fructose- and glucose-stimulated growth of Anabaena, showing that this cyanobacterium can grow mixotrophically with these sugars. To investigate whether the identified ABC components of glucoside transporters are involved in sugar-stimulated growth, we tested mixotrophic growth in their mutants. Whereas the glsC and glsD mutants were drastically impaired in sucrose-stimulated growth, the glsP, glsQ and glsR mutants were impaired at a lower level. All the mutants were also somewhat impaired in fructose- and glucose-stimulated growth suggesting that these sugars can taken up, at least in part, by the glucoside transporter(s). The Anabaena genome contains 12 genes encoding putative components of ABC glucoside transporters: four SBPs, six TMDs and two NBDs. This information and our results suggest the presence in Anabaena of at least three ABC glucoside transporters, one of which may be constituted by GlsR (SBP), GlsP-GlsQ (TMDs) and GlsC-GlsD (NBDs). Additional SBPs may be used by the membrane complex of this transporter, and the NBD proteins (GlsC and GlsD) appear to be shared by the three glucoside transporters, for which there are precedents in well-known ABC transporters. Bacterial Adenylate Cyclase Two Hybrid (BACTH) analysis has shown protein-protein interactions (GlsC-GlsD; GlsC-GlsQ; GlsD-GlsP) that are consistent with this proposal. The effect of inactivation of some gls genes on the diazotrophic growth of Anabaena suggested the possibility of a limited transfer of sucrose to the heterocysts in some of these mutants. We found that the glsC, glsP and hepP mutants were impaired in the intercellular transfer of esculin, and we then extended our study to the intercellular transfer of calcein and 5–CF in all the gls mutants and the hepP mutant. All the glucoside transporter mutants are especially affected in the intercellular transfer of calcein, resembling the phenotype of sepJ mutants. As mentioned above, SepJ is a putative component of septal junctions, and we found that GlsP, GlsQ and HepP interact with SepJ in BACTH analysis, suggesting that GlsP, GlsQ and HepP are required for the correct function of septal junctions. On the other hand, GlsC influences the localization of SepJ and the number of septal peptidoglycan nanopores formed in Anabaena. These results suggest a specific role of GlsC influencing the formati on of septal junctions. In conclusion, the heterocyst-forming cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 expresses glucoside transporters that have a role in sugar assimilation supporting mixotrophic growth. Additionally, these glucoside transporters influence intercellular communication mediated by the septal junction complexes. es
dc.format application/pdf es
dc.language.iso spa es
dc.rights Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional *
dc.rights.uri http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ *
dc.title Role of glucoside transporters in the biology of the heterocyst-forming cyanobacterium anabaena SP. es
dc.type info:eu-repo/semantics/doctoralThesis es
dc.type.version info:eu-repo/semantics/publishedVersion es
dc.rights.accessrights info:eu-repo/semantics/openAccess es
dc.contributor.affiliation Universidad de Sevilla. Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular es
idus.format.extent 184 p. es
Size: 18.39Mb
Format: PDF

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