Aproximación inmunológica y molecular a la estructura cuaternaria y regulación en cultivos sincrónicos de la ferredoxina-nitrito reductasa de chlamydomonas reinhardtii

Abstract

En este trabajo hemos pretendido estudiar tres aspectos a nuestro juicio críticamente importantes en relación con la Fd-NiR de Chlamydomonas reinhardtii.1. Por una parte, hemos intentado esclarecer la estructura cuaternaria de la enzima, teniendo en cuenta la controversia que se ha generado en torno a la composición en subunidades de esta proteína. Este estudio lo hemos llevado a cabo basándonos f undamentalmente en una aproximación inmunoquímica.2. Por otra parte, hemos estudiado la regulación que presenta la Fd-niR en cultivos de Chlamydomonas reinhardtii sometidos a ciclos 12L:12D, y la relación de su comportamiento con el ciclo celular de alga, combinando los estudios inmunoquímicos a nivel de proteína con los de la actividad enzimática. 3. Finalmente, dado que hasta la fecha se carece de información acerca de la biología molecular de esta enzima en algas en general, y en Chlamydomonas reinhardtii en particular, hemos iniciado la aproximación de biología molecular, mostrándose los resultados logrados hasta la fecha.La ferredoxina-nitrito reductasa (Fd-NiR) de Chlamydomonas reinhardtii es una proteína monomérica de 63 kda. La enzima puede sufrir rotura proteolítica en dos fragmentos de 40 y 25 kda, el primero de los cuales retiene el dominio de interacción con la Fd. La cadena de 63 kda presenta reacción cruzada en inmunoblot con la Fd-Glutamato sintasa de Chlamydomonas reinhardtii, así como con las Fd-NiRs de otras algas verdes y, en menor grado, con las Fd-NiRs de plantas y cianobacterias. La fluctuación diaria de la Fd-NiR en cultivos sincrónicos de Chlamydomonas reinhardtii se debe a la síntesis/degradación de la proteína. La síntesis está asociada a los periodos de crecimiento celular y no parece estar sometida al control de un ritmo circadiano. Esta síntesis se produce en respuesta a la ausencia de NH4+ y a la disponibilidad de esqueletos carbonados, con independencia de la luz. Usando el CDNA de la Fd-NiR de espinaca hemos aislado un clon genómico de Chlamydomonas reinhardtii que hibrida a un APNM de 0.9 kb relacionado con el metabolismo del N.