Efectos de las concentraciones subinhibitorias de ampicilina sobre la transferencia de plásmidos R en escherichia coli

Abstract

El rango de acción de los agentes antimicrobianos frente a los microorganismos es ampliamente conocido en la actualidad y va desde cambios metabólicos sin alteraciones morfológicas, cambios en las estructuras internas, alteraciones morfológicas externas, inhibición del crecimiento y por último muerte del microorganismo. Esta amplitud de acción de los antimicrobianos se ha venido expresando en términos de concentración del antibiótico que bien inhibe (efecto bacteriostático) o mata (efecto bactericida) al microorganismo “in vitro”. Esta acción antibacteriana ha sido posteriormente confirmada usando los antimicrobianos en infecciones en animales de experimentación “in vivo”, antes de extrapolar los resultados., utilizando estos antibióticos en el tratamiento de las infecciones en humanos. El término más utilizado para determinar la actividad de un antibiótico frente a cualquier bacteria se denomina Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), que se define como la más baja concentración de antibiótico que inhibe el crecimiento de un cultivo de 18 horas a 35ºC en el que hemos inoculado un número aproximado de 105bacterias/ml. Las unidades de este parámetro se expresan en μg/ml. En los últimos años se ha comprobado que las concentraciones de antibióticos inferiores a la CMI producen alteraciones sobre las bacterias diferentes en un amplio rango a las producidas con la CMI. Estos efectos producidos sobre las bacterias sometidas a concentraciones subinhibitorias de antibióticos pueden ser evaluados observando cambios en la morfología, estructura, bioquímica y tasa de multiplicación bacterianas. Es importante reseñar el término Concentración Antibiótica Mínima (CAM) que define la menor concentración de un antibiótico que produce alteraciones morfológicas en la estructura bacteriana, disminuye la tasa de crecimiento o ambas. El término CAM lo podemos definir en dos aspectos diferentes como CAM de “morfología y estructura”, que es la menor concentración de antibiótico que produce alteraciones estructurales y morfológicas visibles al microscopio óptico con un aumento de 100.000 o al microscopio electrónico, en comparación con un control crecido en medio libre de antibiótico en las mismas condiciones, o como CAM de “inhibición”, que indica la menor concentración de antibiótico que produce una disminución del 90% en la población bacteriana comparada con el control sin antibiótico. Una forma de expresar el efecto de las concentraciones subinhibitorias de antibióticos “in vitro” es examinando la relación existente entre CMI y CAM, como definió por primera vez V. Lorian en el caso de la ampicilina frente aEscherichia coli. Los efectos de los antibióticos sobre la morfología bacteriana, empezaron a observarse desde el comienzo del empleo de los mismos en el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Estos trabajos eran en su mayoría descriptivos y se limitaban a observar la aparición de formas alteradas, inducidas por los antibióticos, en diferentes géneros bacterianos. Posteriormente Lederberg describe largos filamentos deEscherichia coli, que resultaban de la exposición del microorganismo a bajas concentraciones de penicilina, la cual inhibía la formación normal de la pared, permitiendo la supervivencia de éste en un medio osmóticamente estable. Así mismo se comprueba la disminución de la tasa de crecimiento deEscherichia coliinducida por concentraciones subinhibitorias de antibióticos. Es, sin embargo recientemente a partir de los años 70 cuando comienza a desarrollarse más profundamente el estudio de los antibióticos empleados a concentraciones subinhibitorias, donde diverso diversos autores destacando entre ellos V. Lorian, hacen un estudio más sistemático de todos los posibles efectos que dichos antibióticos pueden causar en las bacterias, haciendo hincapié en los patógenos más habituales aislados en muestras clínicas. Estas alteraciones morfológicas de las bacterias con producción de largos filamentos o esferoplastos en los bacilos gram-negativos, podría deberse a la inhibición selectiva de la D-alanina carboxipeptidasa, que inhibirá o prevendría la formación de los septos de la pared en las células de Escherichia coli tratadas con benzylpencilina o ampicilina. Igualmente habría que considerar la afinidad de los antibióticos B-lactámicos por ciertas proteínas de la pared celular, sobretodo sobre las proteínas de unión a penicilinas (PBPs). En el caso de la ampilicina se ha comprobado que actúa principalmente sobres las PBPs Ib y III deEscherichia coli. La primera tiene una acción importante en el crecimiento celular, destacando su papel en la producción de la lísis bacteriana, mientras que la PBP III está íntimamente relacionada con la síntesis del peptidoglicano, permitiendo la septación y división celular. Ambas junto con la PBP II son de gran importancia en la biosíntesis de la pared celular. Es importante reseñar que si la unión de la ampicilina se hace primeramente a la Ib ocurriría la lísis bacteriana, mientras que si se une primero a la III daría lugar a formas alargadas o esferoplastos. Posteriormente se descubrió que las bajas concentraciones de penicilina podrían inhibir tanto la síntesis de proteínas como la del ARN. Esto se ha visto confirmado ya que Lorian et al., comprobaron estudiando P. mirábilissometidos a concentraciones subinhibitorias de ampicilina, que se producía una disminución en el número y distribución de los ribosomas incluso antes de alterarse la morfología de la pared celular. Por otro lado sabemos que en todo proceso infeccioso intervienen una serie de factores que dependen tanto de la capacidad infectiva del microorganismo como de los mecanismos de defensa del huésped. Diversos autores han estudiado como las concentraciones subinhibitorias de antibióticos podrían alterar estos factores. Así se ha estudiado que los cambios morfológicos producidos en la pared bacteriana como consecuencia de la acción de los antibióticos B-lactámicos y en menor grado los aminoglicósidos conllevan cambios en la estructura antigénica de algunos bacilos gram-negativos. Otros autores han estudiado como las concentraciones subinhibitorias de antibióticos actúan sobre la adherencia bacteriana utilizando cepas de Escherichia coli, ya que es de sobra conocido como la adherencia de las bacterias a las células humanas es el primer paso indispensable para ejercer su acción patógena. Sin embargo los resultados obtenidos son todavía contradictorios ya que algunos antibióticos inhiben la adherencia, mientras otros no la alteran o incluso son capaces de aumentarla. Así mismo, la aplicación en la práctica clínica del tratamiento de pacientes con concentraciones subinhibitorias de antibióticos se ha visto refrenado con diversos trabajos, comprobándose como las concentraciones subinhibitorias de algunos antibióticos consiguen la resolución de algunos procesos infecciosos en humanos. Esta acción antibacteriana que se ejerce a bajas concentraciones de antibióticos, puede permitir la resolución de la infección al reducir el número de bacterias en un 90% y al inducir cambios morfológicos que podrían hacer o no más susceptible la bacteria a los mecanismos de defensa del huésped como la fagocitosis y acción lítica del suero y del complemento y alterar la capacidad de adherencia del microorganismo. Por otro lado debemos considerar que la aparición de formas anormales de bacterias en muestras clínicas y cultivos de enfermos tratados con antibióticos, es frecuente en la actualidad y no se debe a ningún artefacto del laboratorio ya que muchos pacientes ingresados en el hospital habían recibido previamente terapia antimicrobiana. Aunque también esta aparición de formas alteradas bacterianas puedan observarse sin relación con terapia antibiótica. Dentro de los diversos campos de estudio sobre las concentraciones subinhibitorias de antibióticos, en nuestro trabajo nos planteamos como éstas podrían afectar a la transferencia de plásmidos R. El destacado papel que los plásmidos tienen en la actualidad, como una de las más importantes causas de resistencia de las bacterias frente a los antibióticos, es de sobra conocido, destacando como propiedades más significativas de ellos: 1. Están constituidos por ADN extracromosómico con replicación autónoma y capacidad de transferirse de una bacteria a otra. 2. Tienen una gran difusión entre los distintos géneros bacterianos sobretodo en las Enterobacterias, que constituyen parte importante de la flora intestinal humana. 3. Confieren resistencia a antibióticos y por tanto pueden transferir esta capacidad de resistencia antibiótica de una bacteria a otra. Una de las principales formas de transferencia plasmídica es mediante la conjugación bacteriana. La conjugación es un proceso altamente específico donde el ADN es transferido desde una bacteria donadora otra receptora por un mecanismo que implica un íntimo contacto célula a célula. La conjugación es determinada casi invariablemente por plásmidos se repliquen más frecuentemente que los genes cromosómicos y éstos sean capaces de transferirse a otras bacterias. Existen por tanto una gran cantidad de plásmidos procedentes de muchas bacterias que son conjugativos. La especificación del sistema de conjugación requiere una gran cantidad de ADN, que ocupa aproximadamente la tercera parte del genoma plasmídico. En el caso de los plásmidos F esto equivale a 33 kilobases y esta gran cantidad de información genética puede estar correlacionada con la eficiencia de transferencia por conjugación que puede llegar al 100% incluso en pequeñas mezclas bacterianas. La conjugación está dividida en dos partes: el reconocimiento de las células receptoras por las donadoras que permite la formación de parejas y posteriormente la transferencia física del plásmido. Centrándonos en la transferencia del ADN plasmídico en el proceso de la conjugación, este proceso incluye, inicio de la transferencia en el origen OriT, en la célula donadora, separación de las dos cadenas de ADN, transferencia de una cadena de la célula donadora a la receptora, síntesis del ADN conjugativo en ambas bacterias y recirculación de la cadena replicada dentro de la bacteria formándose el plásmido completo. Los plásmidos se clasifican en diversos grupos de incompatibilidad en función de que se mantengan de manera estable dentro de una misma célula. Dos plásmidos del mismo grupo no pueden coexistir de modo estable en la misma bacteria por lo que uno de ellos será eliminado y serán por tanto clasificados como pertenecientes al mismo grupo de incompatibilidad. Se cree que este fenómeno refleja una competencia por el lugar específico de unión a la membrana celular. Esta característica ha permitido clasificarlos, conociéndose en la actualidad más de 20 grupos distintos de incompatibilidad. Así mismo las bacterias gram-negativas que poseen plásmidos conjugativos son capaces de sintetizar unos orgánulos extracelulares llamados pilis que son esenciales para el reconocimiento de las células receptoras y para la formación de parejas con ellas, siendo a través de ellos por donde se realiza el paso plasmídico de una bacteria a otra. La formación de estas parejas son el primer paso importante antes de iniciarse la conjugación bacteriana. Este hecho estudiado por diversos autores ha demostrado que las bacterias durante la conjugación forman más que parejas individuales agrupaciones de bacterias donadoras y receptoras, formando grupos o agregados bacterianos. Estos pilis sintetizados por las bacterias son de diverso tipo y han podido diferenciarse mediante la adsorción con bacteriófagos pili-específicos y también observando su morfología con el microscopio electrónico. Los pilis pueden ser rígidos o flexibles, gruesos o delgados. Habiéndose comprobado que los plásmidos que sintetizan pilis rígidos y algunos gruesos flexibles transfieren eficazmente cuando la conjugación se realiza sobre superficie en medio sólido, mientras que los plásmidos que determinan pilis delgados flexibles también pueden transferir eficazmente en medio líquido. En base a lo anteriormente dicho, en nuestro trabajo nos propusimos estudiar como actuaría la ampicilina en concentraciones subinhibitorias sobre la conjugación bacteriana y la transferencia de plásmidos de resistencia. Para ello seleccionamos 14 plásmidos conocidos pertenecientes a diferentes grupos de incompatibilidad y que poseían distinto peso molecular. Todos ellos eran albergados enuna cepa de Escherichia coli J53. A esta cepa con cada uno de los 14 plásmidos albergados, le determinamos: 1. Comprobación de la sensibilidad antibiótica codificada por estos plásmidos por un método cualitativo (disco-placa) y otro cuantitativo (dilución en agar). 2. Demostración de la existencia de los 14 plásmidos en la cepa estudiada y posterior cálculo de su peso molecular. 3. Frecuencia de transferencia de los plásmidos estudiados. Para ello conjugamos esta cepa portadora de los plásmidos con otra de Escherichia coliHfr Rifr de probada capacidad receptora. a) Previamente a la realización de la conjugación bacteriana, determinamos la frecuencia de mutación de resistencia espontánea a rifampicina a la cepa con los 14 plásmidos estudiados, por ser este antibiótico el marcador cromosómico de resistencia en la cepa receptora. b) Posteriormente realizamos la conjugación, calculando la frecuencia de transferencia de los plásmidos, con la cepa portadora previamente tratada con concentraciones subinhibitorias del antibiótico. Realizado en paralelo con la con los mismos plásmidos usada como control sin tratamiento antibiótico. Hay que destacar que la temperatura de conjugación fue de 35º C en todos, excepto en el caso de los plásmidos R27 y R144, realizada a 25º C. Este proceso se realizó con dos variantes: 1) Calculando la frecuencia de transferencia de los plásmidos utilizando distintos tiempos de conjugación: 30, 60, 90 y 120 minutos. Tanto en los controles como al tratar la cepa portadora con concentraciones subinhibitorias de ampicilina durante dos horas. 2) Por otro lado cambiando los tiempos de tratamiento de las cepas con ampicilina, que fueron de 2, 6, 20 y 24 horas previas a la realización de la conjugación. En este proceso se utilizaron la mitad de los plásmidos estudiados y se mantuvo el tiempo de conjugación de las cepas fijo en dos horas. 4. Afectación de la permanencia de los plásmidos dentro de las células de Escherichia coli al tratarlas éstas con concentraciones subinhibitorias de ampicilina, basándonos en el hecho de que existen diversos antibióticos como rifampicina y novobiocina y algunos agentes químicos que en determinadas concentraciones son capaces de liberar o curar de plásmidos a las bacterias portadoras de ellos. 5. La afectación de la morfología bacteriana al tratar dichas bacterias con concentraciones subinhibitorias de ampicilina, con tiempos de tratamiento de 2, 6, 20 y 24 horas. 6. Por último determinamos como se afectaría la formación de agregados bacterianos durante la conjugación, en los cuatro tiempos usados, en las cepas tratadas con concentraciones subinhibitorias de ampicilina, comparadas con los controles sin antibiótico. Ya que como se ha visto anteriormente la formación de parejas o agregados de bacterias durante la conjugación es el primer paso antes de la iniciación de la transferencia plasmídica. A tenor de lo anteriormente expuesto consideramos de gran interés profundizar en el estudio de las concentraciones subinhibitorias de antibióticos y como éstas pueden afectar al proceso de la conjugación bacteriana, incluyendo la afectación de la morfología celular, curación o liberación de plásmidos y formación de agregados bacterianos necesarios para la transferencia de plásmidos de Resistencia que tanta transcendencia tienen en la microbiología clínica actual.