Diseño y construcción de vectores con genes de luciferasa eucarióticos como sistema informador. Aspectos aplicados

Abstract

Los genes informadores son herramientas que tienen una gran variedad de aplicaciones en biología molecular. El trabajo desarrollado en esta tesis doctoral se basa en la utilización de los genes luc y lucor como genes informadores. Para ello se han diseñado y construido una serie de vectores para expresar estos genes en diferentes bacterias gram negativas. Se clonaron los genes luc y lucor bajo el control de los promotores r1, pr, y ptrc en un vector de amplio rango de hospedador. A partir de aquí se seleccionaron las fusiones pr: lucor y laciq-ptrc: lucor y se construyeron una serie de minitransposones para el marcado cromosómico y estable de bacterias gram negativas. A continuación se realizaron diferentes aplicaciones con las distintas construcciones desarrolladas. En primer lugar se diseño un método rápido y fácil con el gen luc para determinar el número de copias de plásmido. En segundo lugar, se ha aplicado la bioluminiscencia a la interacción rhizobium-leguminosa, por un lado se describe un método que facilita los estudios de ocupancia de nódulos mediante el marcado de cepas de rhizobium con el gen luc; por otro lado, se ha establecido por primera vez en rhizobium un plasmido derivado del replicon r388 que marcado con el casete ci857-pr: lucor resulto totalmente estable en rhizobium; y por ultimo, se ha aplicado una cámara amplificadora de fotones a la detección y seguimiento de rizobios marcados con el plasmido peb42c en las primeras etapas de la simbiosis. En tercer lugar, se han construido dos minitransposones, pteb311 y pteb411, con los genes lucor y luc sin promotor para utilizarlos como sondas en la búsqueda al azar de regiones promotoras. En cuarto lugar se ha desarrollado un vector sonda, psor, con el gen lucor como informador en la búsqueda de promotores, para determinar expresión génica en organismos procariotas. En ultimo lugar se ha establecido un sistema modelo para el análisis de transferencia de plásmidos