Determinación de residuos de fármacos y sus metabolitos en plantas silvestres. Ensayos de exposición y evaluación de la bioactividad

Abstract

Actualmente la presencia de sustancias farmacológicas en las aguas empleadas para el regadío o en las matrices vegetales es una problemática para el medioambiente, siendo cada vez, más necesario evaluar, monitorizar y realizar un diagnostico medioambiental de las zonas afectadas por la contaminación para conocer los ecosistemas dañados por la presencia de los contaminantes y así evaluar la consecuencia de estos en los seres vivos. Por ello, esta Tesis centra su estudio en los efectos de la contaminación sobre la flora autóctona del Parque Nacional de Doñana, aportando datos cualitativos y cuantitativos al efecto de sustancias farmacológicamente activas (como los contaminantes emergentes) en tres especies de plantas de esta zona, además los estudios al respecto son prácticamente inexistentes. Este trabajo pretende incrementar el conocimiento sobre las consecuencias de la presión antropogénica en el ecosistema del Parque Nacional de Doñana, simulando a escala de laboratorio la presencia de los principales activos farmacológicos, sus compuestos de degradación y metabolitos, en matrices vegetales de este entorno natural, evaluando también la capacidad antioxidante y enzimática así como la identificación de moléculas inhibidoras de dichas enzimas en una colección de 150 plantas del mencionado entorno protegido. Se ha optimizado y validado un procedimiento analítico utilizando cromatografía líquida de alta resolución con detección de espectrometría de masas-tiempo de vuelo para la para para la detección identificación y la cuantificación de seis principios activos farmacológicos, carbamazepina, flumequina, ciprofloxacina, enrofloxacina, ibuprofeno y diclofenaco, en extractos de tres especies vegetales: Lavandula dentata, Juncus sp. y Salicornia europaea, especies presentes en diferentes hábitats del parque Nacional de Doñana (España). El procedimiento permite recuperaciones de entre el 60 y el 100% para la carbamazepina en todas las matrices, alrededor del 70% para enrofloxacina y ciprofloxacina, del 70% para ibuprofeno y entre el 80 y el 90% para diclofenaco. Se ha diseñado y realizado un ensayo de exposición sometiendo ejemplares de las especies vegetales seleccionadas a riegos con disoluciones acuosas conteniendo concentraciones variables de los principios activos ya mencionados. Se han analizado las diferentes partes de las plantes realizando cortes a los 7, 15, 21 y 30 días (fin del ensayo) y determinando la absorción de los mismos en las diferentes partes de la planta. Con técnicas de análisis no dirigido se han evaluado las muestras sometidas a los ensayos de exposición e identificar y, en su caso determinar, metabolitos y productos de degradación. Se han evaluado las cantidades de principio acumuladas en las diferentes partes de las plantas a lo largo del ensayo de exposición, identificando los posibles metabolitos generados en las diferentes partes de las plantas sometidas al ensayo de exposición, y las principales rutas metabólicas que pudieran estar implicadas, mediante el análisis masivo de los datos cromatográficos a través de un software apropiado (Metabolynx TM), atendiendo los resultados a la concentración de principios activos en el agua de riego, tiempo de ensayo, parte de la planta y evolución fisiológica aparente de los ejemplares vegetales. Adicionalmente se optimizaron métodos para evaluar las actividades antioxidantes e inhibidoras, empleando diferentes enzimas (tirosinasa, elastasa, colagenasa y lipoxigenasa), en los extractos de una selección de 150 plantas presentes en el Parque Nacional de Doñana, para ello se recolectaron ejemplares de 150 especies vegetales presentes en el Parque Nacional de Doñana y su entorno, realizando extracciones de estos usando disolventes de diversa polaridad y capacidad extractante: hexano, etanol, agua: etanol (1:1, v/v) y acetato de etilo. Dichos métodos fueron aplicados para evaluar la capacidad de inhibición enzimática así como capacidad antioxidante en dicha colección de 150 plantas y en muestras seleccionadas de los ensayos de exposición justificando como era de esperar el aumento de la capacidad inhibidora a las enzimas en las muestras sometidas a altas concentraciones de disoluciones dopantes. Estableciendo una relación metabólica entre las posibles moléculas bioactivas de los extractos de las plantas que no están documentados en la bibliografía por su actividad de inhibición enzimática y los inhibidores conocidos de dichas enzimas, explicando así la existencia de la actividad inhibidora.

Actuellement, la présence de substances pharmacologiques dans l'eau utilisée pour l'irrigation ou dans les matrices végétales est un problème pour l'environnement, étant de plus en plus nécessaire pour évaluer, surveiller et faire un diagnostic environnemental des zones affectées par la pollution afin de connaître les écosystèmes endommagés par la présence de polluants et ainsi évaluer les conséquences de ceux-ci sur les êtres vivants. Pour cette raison, cette thèse se concentre sur les effets de la pollution sur la flore indigène du Parc National de Doñana, en fournissant des données qualitatives et quantitatives sur l'effet des substances pharmacologiquement actives (telles que les contaminants émergents) sur trois espèces végétales dans cette zone, et les études sont pratiquement inexistantes. Ce travail vise à accroître les connaissances sur les conséquences de la pression anthropique dans l'écosystème du Parc National de Doñana, en simulant à l'échelle du laboratoire la présence des principaux actifs pharmacologiques, leurs composés de dégradation et métabolites, dans les matrices végétales de cet environnement naturel, en évaluant également la capacité antioxydante et enzymatique ainsi que l'identification des molécules inhibitrices de ces enzymes dans une collection de 150 plantes du milieu protégé mentionné ci-dessus. Une procédure analytique a été optimisée et validée par chromatographie liquide à haute performance avec détection par spectrométrie de masse à temps de vol pour la détection et la quantification de six principes pharmacologiques actifs, carbamazépine, flumequine, ciprofloxacine, enrofloxacine, ibuprofène et diclofénac, en extraits de trois espèces végétales, Lavandula dentata, Juncus sp. et Salicornia europaea, espèces présentes dans différents habitats du Parc national de Doñana (Espagne). La procédure permet une récupération de 60-100% pour la carbamazépine dans toutes les matrices, environ 70% pour l'enrofloxacine et la ciprofloxacine, 70% pour l'ibuprofène, et 80-90% pour le diclofénac. Un test d'exposition a été conçu et réalisé en soumettant des spécimens des espèces végétales sélectionnées à une irrigation avec des solutions aqueuses contenant des concentrations variables des principes actifs déjà mentionnés. Les différentes parties des plantes ont été analysées en effectuant des coupes à 7, 15, 21 et 30 jours (fin de l'essai) et en déterminant leur absorption dans les différentes parties de la plante. Des techniques d'analyse non ciblées ont été utilisées pour évaluer les échantillons soumis à des essais d'exposition et pour identifier et, le cas échéant, déterminer les métabolites et les produits de dégradation. Les quantités de principe accumulées dans les différentes parties des plantes au cours de l'essai d'exposition ont été évaluées, en identifiant les métabolites possibles générés dans les différentes parties des plantes soumises à l'essai d'exposition, et les principales voies métaboliques qui pourraient être impliquées, au moyen de l'analyse massive des données chromatographiques par un logiciel approprié (Metabolynx TM), compte tenu des résultats des concentrations en principes actifs de l'eau d'irrigation, du temps de test et des modifications phytochimiques et apparentes des spécimens. En outre, les méthodes d'évaluation des activités antioxydantes et inhibitrices ont été optimisées en utilisant différentes enzymes (tyrosinase, élastase, collagénase et lipoxygénase) dans les extraits d'une sélection de 150 plantes présentes dans le Parc National de Doñana, et à cette fin, des spécimens de 150 espèces végétales présentes dans le Parc et ses environs, en les extrapolant avec différents solvants, de polarité et de capacité différentes : hexane, éthanol, eau : éthanol (1:1, v/v) et acétate d'éthyle. Ces méthodes ont été appliquées pour évaluer la capacité d'inhibition enzymatique ainsi que la capacité antioxydante dans cette collection de 150 plantes et dans des échantillons choisis parmi les tests d'exposition justifiant comme prévu l'augmentation de la capacité inhibitrice aux enzymes dans les échantillons soumis à de fortes concentrations de solutions dopantes. Établir une relation métabolique entre les molécules bioactives possibles d'extraits végétaux non documentés dans la littérature pour leur activité d'inhibition enzymatique et les inhibiteurs connus de ces enzymes, expliquant ainsi l'existence d'une activité inhibitrice.

The presence of pharmaceuticals in environmental waters or plant matrices suppose a challenge for environment preservation, which makes necessary to evaluate, monitor and carry out an environmental diagnosis of the areas affected by pollution in order to know the ecosystems damaged by the presence of pollutants and thus evaluate the consequences of these on living beings. For this reason, this Thesis focuses its study on the effects of pollution on the native flora of the Doñana National Park (Spain), providing qualitative and quantitative data on the effect of pharmacologically active substances (such as emerging contaminants) in three plant species in this area, in addition similar studies are virtually nonexistent. This work aims to increase knowledge about the consequences of anthropogenic pressure in the ecosystem of Doñana National Park, simulating at laboratory scale the presence of pharmaceuticals, their degradation compounds and metabolites, in plant matrices from this natural environment. The antioxidant and enzymatic capacity as well as the identification of inhibitory molecules to the enzymes used in this study were evaluated in a collection of 150 selected plants from Doñana. An analytical procedure using high resolution liquid chromatography with detection of mass spectrometry - flight time has been optimized and validated for the identification and quantification of six active pharmacological principles, carbamazepine, flumequine, ciprofloxacin, enrofloxacin, ibuprofen and diclofenac, in extracts from three plant species: Lavandula dentata, Juncus sp. and Salicornia europaea. An uptake study has been carried out, irrigating the selected plants with aqueous solutions containing variable concentrations of the pharmaceuticals. The samples have been analyzed at 7, 15, 21 and 30 days (end of the assay) and the accumulation of the selected substances have been determined. Additionally, non-targeted analytical techniques using appropriate software (MetabolynxTM) have been applied to data from the samples subjected to the uptake study to identify possible metabolites and degradation products and possible metabolic routes involved. Additionally, some methods were optimized to evaluate antioxidant and inhibitory activities, using different enzymes (tyrosinase, elastase, collagenase and lipoxygenase), in the extracts of a selection of 150 plants from the Doñana National Park. For this purpose, the specimens were extracting using solvents of different polarity and extracting capacity: hexane, ethanol, water: ethanol (1:1, v/v) and ethyl acetate. These methods were applied to evaluate the enzymatic inhibition capacity as well as antioxidant capacity of the extracts. Keywords: Lavandula dentata; Juncus sp.; Salicornia europaea; drugs; uptake assay; carbamazepine; flumequine; ciprofloxacin; enrofloxacin; ibuprofen; diclofenac; Doñana National Park; metabolites; enzymes; enzymatic inhibition; tyrosinase; lipoxygenase; collagenase; elastase; antioxidants.