Carbohydrate multivalent systems to functionalize proteins and surfaces for lectin interaction studies

Abstract

Las interacciones entre proteínas y carbohidratos están involucradas en muchos eventos biológicos fundamentales. En estos procesos, una clase de proteínas que reconocen azúcares denominadas lectinas juegan un papel crucial. Actualmente, numerosos grupos de investigación se encuentran estudiando esta importante clase de proteínas; sin embargo, muchas de ellas están aún por explorar y no se conoce en detalle sus especificidades frente a carbohidratos y los factores moleculares que gobiernan dicha interacción. En la naturaleza, muchas lectinas se encuentran en forma de oligómeros para promover una elevada para glicanos específicos. Esto se debe al hecho de que la interacción carbohidrato-proteínas es muy débil, con una especificidad y selectividad limitadas por unidad de azúcar. Por lo tanto, para compensar esta interacción paradójicamente débil, la Naturaleza juega la carta de la multivalencia mediante una presentación multivalente del receptor, así como de los carbohidratos. En este sentido, con el objetivo de estudiar estos procesos multivalentes de reconocimiento entre carbohidratos y proteínas, los sistemas de carbohidratos multivalentes artificiales se han revelado como herramientas muy eficientes para el estudio de dichas interacciones. En este contexto, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral es el desarrollo y la preparación de sistemas multivalentes de carbohidratos para comprender mejor los mecanismos que impulsan las interacciones de estas proteínas de unión a carbohidratos. Para lograr este objetivo general, se propusieron los siguientes objetivos específicos:

• Preparación de superficies multivalentes basadas en glicodendrones y el estudio de la interacción carbohidrato-proteína sobre dichas superficies, para evaluar el efecto de la presentación del ligando en la interacción. Para alcanzar este objetivo, hemos desarrollado microarrays recubiertos con dendrones de ciclooctino, a partir de los cuales se han generado los correspondientes glicodendrones directamente sobre el chip, a través de una reacción de tipo click en ausencia de Cu (SPAAC) con diferentes tipos de carbohidratos funcionalizados con un grupo azida en su extremo reductor. Las superficies hidrófobas utilizadas permiten el uso de la detección por medio de la espectrometría de masas MALDI-TOF, permitiendo así verificar la finalización de cada reacción (>95%). Con este nuevo método se realizaron varios estudios de interacción usando lectinas marcadas fluorescentemente, fundamentalmente ConA y DC-SIGN. En particular, se observó una fuerte unión para el disacárido αMan1,2Man, en todas las valencias y concentraciones empleadas. Como se esperaba, la señal fluorescente aumenta al aumentar la valencia todas las concentraciones utilizadas. En estos estudios también se ha puesto de manifiesto que las lectinas que reconocen manos, no muestran ninguna interacción para los glicodendrones de β-D-galactosa. Todos estos resultados demuestran la eficacia y la versatilidad real de la técnica desarrollada.

• Preparación de nuevas glycodendriproteinas mediante la funcionalización de la proteína BSA con carbohidratos y evaluación de su interacción con lectinas. Se ha desarrollado un método de preparación rápido, simple, económico y versátil de proteínas funcionalizadas con glicodendrones. En primer lugar, se han sintetizado varias familias de glicodendrones con un grupo azido en la posición focal. Estos grupos funcionales se han utilizado para conjugar las moléculas en la proteína BSA mediante metodologías de reacción de tipo click catalizada por Cu(I) (CuAAC) entre los grupo azida de los glicodendrones y los grupos alquino en la proteína, previamente derivatizada con este grupo funcional. Así, fue posible alcanzar dos grados de funcionalización, bajo (10-15 unidades de azúcar) y alto (30-35 unidades de azúcar). Las neoglicoproteínas sintetizadas han mostrado una buena actividad inhibitoria frente a lectinas lectinas humanas como Langerin y DC-SIGN. En particular, excelentes resultados fueron obtenidos con las neoglicoproteínas funcionalizadas con glicodendrones de αMan1,2Man. De hecho, estas estructuras han revelado una actividad, en terminos de inhibición de la actividad enzimática, en el rango bajo nanomolar. Esto demuestra que la proteína es una buena plataforma para exhibir, y de este manera, mejorar el reconocimiento de los glicanos frente a los receptor de azucares.

• Diseño y desarrollo de una síntesis rápida que permita obtener el disacárido Mana1,2Man en gran escala y, con ello, permitir la preparación de estructuras de glicodendrones. Este objetivo se ha logrado mediante la adopción de una síntesis consecutiva de 5 etapas para obtener el aceptor de glicosilo, reduciéndose de manera significativa el coste total y el tiempo de preparación de este intermedio clave. Usando esta estrategia, fue posible obtener el disacárido deseado en escala de gramos y en menos de dos días y sobre todo con una mejoría del 30% sobre el rendimiento global, en comparación con la estrategia sintética tradicional paso a paso. Con este disacárido Manα1,2Man, se han preparado glicodendrones con biotina en la posición focal. Estos glicodendrones se van a utilizar, en el futuro, para estudios de interacción con lectinas empleando la resonancia de plasmón de superficie de imagen (SPRi).