Vitrification of human oocytes employing a closed carrier with enhanced thermal efficiency and short times of exposure to synthetic cryoprotectant solutions.

Abstract

La criopreservación consiste en la reducción de la temperatura del organismo, con el objetivo de detener de por completo la cinética de las reacciones biológicas que mantienen la homeostasis celular, y que al mismo tiempo provocan el envejecimiento de las mismas. Al arrestar el metabolismo celular, se logra la preservación del material biológico por tiempo indefinido. El principal problema asociado a la disminución de la temperatura de una célula para tal propósito es la tendencia a la cristalización del medio acuoso intracelular durante el enfriamiento. La configuración natural de los grupos de moléculas de agua dentro de las células es el estado desordenado propio del estado líquido. Sin embargo, el agua, al adquirir la estructura cristalina propia del hielo, se expande, dañando las estructuras biológicas y comprometiendo su viabilidad. La vitrificación es una transición de fase de segundo orden alternativa a la cristalización, en la que la solución acuosa adquiere propiedades de un sólido manteniendo el desorden natural de las moléculas de agua y solutos presentes en el citosol. Debido a que no se produce la reconfiguración molecular propia de la formación de hielo, permite mantener el sistema biológico que se pretende preservar sin alteraciones. Por lo tanto, para la criopreservación de material biológico, concretamente óvulos humanos en el caso de esta tesis, es necesario que el medio intracelular alcance el estado vítreo y se evite la formación de hielo, si no por completo, al menos cantidades lesivas del mismo. Existen diferentes estrategias para alcanzar el estado vítreo, pero en esta tesis nos centraremos en la técnica de vitrificación ultrarápida. Dicha técnica consiste en realizar el enfriamiento, desde la temperatura ambiente hasta temperaturas criogénicas estables (normalmente los -196 ºC del nitrógeno líquido), y posteriormente el recalentamiento, a altas velocidades. El gameto femenino —el óvulo— es la célula humana de mayor tamaño. Para su criopreservación en el contexto de la reproducción humana asistida, este se encuentra en un estado de arresto en la metafase de la segunda división meiótica, preparado para la fecundación. Su gran tamaño y la presencia de orgánulos muy sensibles hacen que su criopreservación sea compleja, comparada con la de embriones en los primeros días de desarrollo. Sólo mediante la técnica de vitrificación ultrarápida, sobre la que se trabaja en esta tesis, se consigue su criopreservación de forma satisfactoria. Durante un proceso de vitrificación ultrarápida, que se produzca o no la indeseada formación de hielo dependerá de las velocidades de enfriamiento y recalentamiento alcanzadas, y de las propiedades de la solución —en este caso el citosol, la fracción líquida intracelular. Con la concentración de solutos y viscosidad del citosol de los óvulos en su estado natural, las velocidades de enfriamiento y recalentamiento necesarias para evitar la formación de hielo serían muy difíciles de obtener. Por este motivo, es necesario aumentar la tendencia a la vitrificación del citosol, con un protocolo de preparación. Esta fase de preparación consiste en aumentar la concentración intracelular de solutos y la viscosidad del citosol, hasta un punto crítico que permita alcanzar la transición vítrea, a las velocidades de enfriamiento y recalentamiento obtenidas por los soportes de vitrificación actualmente disponibles. Para ello, el óvulo se expone a una serie de soluciones hipertónicas, que provocan la permeación de solutos hacia el interior celular y la salida de agua. Una vez concluida la preparación, el óvulo se coloca en un soporte de vitrificación —pajuela— y se procede al enfriamiento, por lo general por inmersión en nitrógeno líquido. En esta tesis se describen dos estudios prospectivos con óvulos de donante llevados a cabo en una clínica de fertilidad (Ginemed Sevilla), en los que se estudia la eficacia del sistema de vitrificación desarrollado por la spin-off de la Universidad de Sevilla Safepreservation, bajo la dirección científica del Dr. Ramón Risco. En el primer estudio, se emplea un kit soluciones de vitrificación cuya novedad es su composición totalmente sintética, sin la presencia de proteínas de origen humano como la albúmina, sustituidas por el polímero hidroxipropil celulosa. Este tipo de moléculas son generalmente empleadas como agentes surfactantes y también desempeñan actividad osmótica. Se comparan los resultados clínicos de un grupo de óvulos vitrificados con soluciones sintéticas frente a otro grupo de óvulos, proveniente de la misma donante, no sometidos a la vitrificación. Se comprueba que la alternativa desarrollada por el grupo de Risco obtiene unos resultados satisfactorios, similares a los obtenidos con soluciones de vitrificación clásicas que incorporan en su formulación proteínas de origen humano o animal, sin las desventajas asociadas a las mismas, como lo son el riesgo de contaminación y una vida útil reducida. En el segundo trabajo se emplea un diseño experimental similar al del primer estudio, para probar la eficacia del soporte cerrado de vitrificación SafeSpeed. El soporte está compuesto por un capilar ultrafino unido a una pajuela de resina ionomérica. El capilar donde se cargan los óvulos para la vitrificación permite maximizar las tasas de enfriamiento y recalentamiento, ya que la eficiencia térmica del mismo es ampliamente superior a la de otros soportes de vitrificación disponibles actualmente. Cabe resaltar también el hecho de que es un sistema cerrado, en el que las muestras biológicas no entran en contacto con el nitrógeno líquido empleado para el enfriamiento y la manipulación, minimizando el riesgo de contaminación por agentes patógenos presentes en el mismo. En este caso también comprobamos que las tasas de supervivencia ovocitaria al procedimiento de vitrificación con este soporte son excelentes, y que el desarrollo de los embriones resultantes de los óvulos vitrificados es similar al obtenido con óvulos que no han sido sometidos a la vitrificación. on estos resultados, queda patente que este sistema de vitrificación desarrollado en la Universidad de Sevilla es una herramienta muy efectiva que permite obtener resultados punteros en el contexto clínico. Sin embargo, los protocolos de vitrificación aún son susceptibles de mejora. A pesar de que el enfriamiento y el calentamiento de las muestras es ultrarápido, el procedimiento en conjunto requiere mucho tiempo, ya que el tiempo estándar para preparar cada grupo de hasta 3 óvulos para la vitrificación lleva de 10 a 15 minutos de exposición a soluciones hipertónicas. Es deseable una reducción de la duración de esta fase para mejorar el flujo de trabajo en el laboratorio de FIV y reducir el tiempo de exposición a crioprotectores potencialmente tóxicos. Con el objetivo de explorar esta posibilidad, decidimos estudiar la dinámica de la permeación de crioproctectores en el ovocito humano. En primer lugar, con una aproximación in silico, mediante un programa desarrollado en MatLab para integrar las dos ecuaciones diferenciales que describen la permeabilidad de la membrana plasmática del óvulo según un modelo 2-P. Estas simulaciones fueron complementadas con observaciones in vivo del comportamiento osmótico de los ovocitos. En un protocolo de preparación de óvulos para la vitrificación clásico, en primer lugar se realiza una exposición prolongada (10-15 minutos) del óvulo a una solución con una concentración intermedia de crioprotectores (≈25% w/w), denominada solución no-vitrificante o solución de equilibrado, seguida de una segunda exposición corta a una solución vitrificante (≈45% w/w). Comparamos la actividad osmótica que se produce en el protocolo estándar contra la de un protocolo corto, basado en la deshidratación, en el que la duración de la exposición de los óvulos tanto a la solución novitrificante como a la vitrificante era limitada a 60 segundos. Comprobamos que la deshidratación del óvulo tras la exposición a soluciones de vitrificación ocurre muy rápido; el punto de volumen mínimo de la curva de contracción y expansión resultante del gradiente smótico se alcanza dentro de los primeros 60 segundos. En ese punto, el contenido de agua intracelular es mínimo, la penetración de crioprotectores de bajo peso molecular es casi completa y, como resultado, la concentración total de soluto intracelular es alta. Por lo tanto, prolongar la primera fase de exposición hasta 15 minutos, según es recomendado en los protocolos actuales, no produce una mejora significativa de la tendencia a la vitrificación del citosol del ovocito, y no mejora presumiblemente sus posibilidades de vitrificar a determinadas tasas de enfriamiento y recalentamiento. Los resultados de las pruebas en óvulos humanos y embriones, no aptos para uso clínico y donados para la investigación, muestran que la tasa de supervivencia a la vitrificación no se ve comprometida por reducir los tiempos de exposición, confirmando que el efecto osmótico deseado se produce en un tiempo reducido. Las innovaciones en las técnicas empleadas para vitrificar las células reproductivas se rigen por la premisa de que se debe mantener un compromiso entre la seguridad y la eficacia; la técnica debe ser lo más aséptica y efectiva posible. Se podría argumentar que SafeSpeed, como soporte cerrado de virificación, cumple con este criterio de mejorar la eficiencia —eficiencia térmica, al menos— sin comprometer la seguridad, y como tal podría considerarse como un avance en la dirección correcta. Igualmente, el uso del polímero sintético hidroxipropil celulosa también representa una alternativa más segura y más estable a proteínas derivadas de humano o animal. Por último, lo mismo podría decirse sobre nuestros intentos de acortar el protocolo de vitrificación: si los ovocitos y embriones demuestran ser igualmente competentes, reducir la duración de la exposición a crioprotectores potencialmente citotóxicos y a temperaturas subóptimas debería ser más seguro. En última instancia, para cada modificación relevante del procedimiento, se debe realizar una ruta de validación bien diseñada antes de su uso en el contexto clínico, desde la etapa preclínica en modelos de mamíferos y material humano donado, hasta estudios clínicos prospectivos controlados.

In the first part of this thesis, the effectiveness of a vitrification system, developed by the spin-off of the University of Seville, Safepreservation, is studied. Two prospective studies with donor eggs, carried out in a fertility clinic (Ginemed Sevilla) were conducted. In the first study, we test a vitrification solution of fully synthetic composition, free of proteins of human origin such as albumin, which are substituted by the polymer hydroxypropyl cellulose. This type of molecules are generally used as surfactants and also perform osmotic activity. The clinical results of a group of oocytes vitrified with these solutions are compared against another group of oocytes, coming from the same donor, not subjected to vitrification. The results show that the synthetic alternative developed by Risco's group provides satisfactory embriology outcomes, similar to those obtained with classic vitrification solutions that incorporate in their formulation proteins of human or animal origin. Yet, without the disadvantages associated to them, such as the risk of contamination and a reduced lifespan. In the second work, an experimental design similar to that of the first study is used to test the effectiveness of the closed vitrification carrier "SafeSpeed". The carrier consists of an ultra-thin capillary attached to a straw of ionomeric resin. The capillary where the oocytes are loaded for vitrification allows to maximize the rates of cooling and warming, since its thermal efficiency is superior to that of other vitrification carriers currently available. It should also be noted that it is a closed carrier, in which biological samples do not come into contact with the liquid nitrogen used for cooling and storage, minimizing the risk of contamination by pathogens. The outcomes of this study show that the ovocytary survival rates to the vitrification procedure with this carrier meet and even exceed current standards, and that the development of the embryos resulting from the vitrified eggs is similar to that of embryos from eggs that have not undergone vitrification. The results of this two studies provide initial evidence that the vitrification system developed at the University of Seville is a very effective tool that allows obtaining benchmark results in the clinical context. However, the vitrification protocols are still susceptible to improvement: although the cooling and warming of the samples is ultra fast, the whole procedure is time consuming, since each group of up to 3 oocytes takes from 10 to 15 minutes of exposure to hypertonic solutions with cryoprotectants to be prepared for vitrification. A reduction in the duration of this phase is desirable to improve workflow in the IVF laboratory and reduce the exposure time to potentially toxic cryoprotectants. In order to explore this possibility, we decided to study the dynamics of the permeation of cryoprocectors in the human oocyte. Firstly, with an in silico approach, through a program developed in MatLab to integrate the two differential equations that describe the permeability of the plasma membrane of the human Metaphase-II oocyte, according to a 2-P model. These simulations were complemented with in vivo observations of the osmotic behavior of the oocytes. The standard protocol for the preparation of oocytes for vitrification consists on a prolonged exposure (10-15 minutes) to a solution with an intermediate concentration of cryoprotectants (≈25% w/w), called a non- vitrifying, or equilibration, solution. This is followed by a second short exposure to a vitrifying solution with higher CPA concentration (≈45% w/w). We compared the osmotic activity that occurs in the standard protocol against that of a short protocol, based on dehydration, in which the duration of exposure of the oocytes to both the non-vitrifying and vitrifying solutions was limited to 60 seconds We verified that the dehydration of the oocyte after exposure to vitrification solutions occurs very fast; the minimum volume point of the contraction and expansion curve resulting from the osmotic gradient is reached within the first 60 seconds. At that point, the intracellular water content is minimal, the penetration of low molecular weight cryoprotectants is almost complete and, as a result, the total concentration of intracellular solute is high. Therefore, prolonging the first exposure phase up to 15 minutes, as recommended in the current protocols, would presumably not reduce the chance of lethal ice formation at certain rates of cooling and warming. The results of tests on human oocytes and embryos, unsuitable for clinical use and donated for research, show that the vitrification survival rate is not compromised by reducing the exposure times, confirming that the desired osmotic effect occurs in a reduced time. Innovations in the techniques used to vitrify reproductive cells are governed by the premise that a compromise must be maintained between safety and efficacy: the technique must be as aseptic and effective as possible. It could be argued that SafeSpeed, as a closed support for virification, meets this criterion of improving efficiency —thermal efficiency, at least— without compromising safety, and as such could be considered a step in the right direction. Likewise, the use of the synthetic polymer hydroxypropyl cellulose also represents a safer and more stable alternative to proteins derived from human or animal. Finally, the same could be said about our attempts to shorten the vitrification protocol: if oocytes and embryos prove to be equally competent, reducing the duration of exposure to potentially cytotoxic cryoprotectants and at suboptimal temperatures should be safer. Ultimately, for each relevant modification of the procedure, a well designed validation route must be performed before its use in the clinical context, from the preclinical stage in models of mammals and donated human material, to prospective controlled clinical studies.