dc.description.abstract | La presente Tesis aborda el estudio de pretratamientos biológicos
destinados a romper la barrera de lignina y mejorar la sacarificación de los
materiales lignocelulósicos utilizados en la obtención de bioetanol de
segunda generación. Los pretratamientos estudiados en esta Tesis están
basados en el uso del sistema enzimático lacasa-mediador y han
demostrado ser eficaces en degradar/modificar la estructura del polímero
de lignina que envuelve y protege a los carbohidratos. Las modificaciones
en la estructura de la lignina permiten que los carbohidratos queden más
expuestos a las enzimas celulasas, lo que se traduce en una mejora
significativa en la hidrólisis de los mismos. Por otro lado, esta Tesis
también plantea el estudio de las interacciones que tienen lugar entre la
lignina y las celulasas, y que afectan al proceso de hidrólisis de la celulosa.
Estos estudios tienen como objetivo un aprovechamiento más racional y
eficaz de los materiales lignocelulósicos en la producción de
biocombustibles de segunda generación (bioetanol).
En esta Tesis se han evaluado dos sistemas lacasa-mediador. El primero
está constituido por una lacasa de alto potencial redox, obtenida del
hongo basidiomiceto Pycnoporus cinnabarinus, y el mediador redox
sintético, 1-hidroxibenzotriazol (HBT). El segundo, incluye una lacasa
comercial obtenida del hongo ascomiceto Myceliophthora thermophila y
el mediador natural siringato de metilo (MeS). Los materiales
lignocelulósicos utilizados en los pretratamientos enzimáticos con el
sistema lacasa-mediador incluyeron: i) residuos agrícolas de paja de trigo,
el bagazo y la paja de la caña de azúcar y ii) madera de paulownia
(Paulownia fortunei). Para el estudio de las interacciones lignina-celulasa
se utilizaron ligninas aisladas de eucalipto (Eucalyptus globulus), paja de
trigo y pícea (Picea abies) .
Los pretratamientos de materiales lignocelulósicos con lacasa de P.
cinnabarinus en presencia/ausencia de HBT, se realizaron sobre dos materias primas, los residuos agrícolas de paja de trigo y de caña de
azúcar, con el objeto de mejorar el rendimiento de sacarificación
enzimática y obtención de bioetanol de ambas materias. Primeramente se
realizaron experimentos del tratamiento sobre la paja de trigo en una
secuencia que incluía un solo ciclo enzimático seguido de una extracción
alcalina con peróxido de hidrógeno. Tras la secuencia se determinó el
contenido en lignina (lignina Klason) y se evaluó el efecto que esta
eliminación/modificación de lignina producía sobre la sacarificación
enzimática (con celulasas). Este pretratamiento produjo un descenso en el
contenido en lignina del 45% respecto a la materia prima y una mejora en
la obtención de glucosa del 60% tras 72 h de tratamiento con celulasas.
También se analizó la modificación de la estructura de lignina con dichos
tratamientos mediante resonancia magnética nuclear bidimensional (2DRMN).
Estos estudios revelaron un descenso en los enlaces β-O-4´y β-5´
así como en las unidades de lignina p-hidroxifenilo (H), guayacilo (G) y
siringilo (S), y una disminución más moderada de los ácidos p-cumárico y
ferúlico, sin variación sustancial en la unidad de tricina.
Con el objeto de estudiar la eficacia del sistema lacasa-mediador sobre
otras materias primas, se estudió la aplicación del mismo sobre los
residuos de la industria de la caña de azúcar (bagazo y paja), en este caso
utilizando una secuencia de 4 ciclos con dosis menores de enzima y
mediador por ciclo. Con esta secuencia se obtuvo un descenso en el
contenido en lignina del 27% y 31% para el bagazo y paja de caña de
azúcar respectivamente, y una mejora del 39% y 46% en el rendimiento de
glucosa, en la materia pretratada de bagazo y paja, en comparación con el
control, tras las 72 h de tratamiento con celulasas. El análisis 2D-RMN
reveló notables cambios en la estructura de la estructura de la lignina,
observándose en ambos materiales un descenso significativo en el
número los enlaces y unidades de lignina.
La eficacia del sistema lacasa-mediador volvió a quedar demostrada con el
pretratamiento realizado sobre madera de paulownia con la lacasa de M.
thermophila y MeS. Dicho pretratamiento constó de una secuencia de 4 ciclos (cada uno de ellos incluía un tratamiento enzimático seguido de una
extracción alcalina). Los mejores resultados se obtuvieron con 50 U·g-1 de
enzima y 3% de MeS, consiguiendo un descenso en lignina del 24%
respecto al control y un aumento en la liberación de glucosa del 40%. Los
análisis de 2D-NMR de estos materiales revelaron un descenso en el
número de enlaces y un aumento de las unidades oxidadas de siringilo y
guayacilo, tras el pretratamiento. Por último, se analizaron los filtrados
obtenidos durante los diferentes ciclos, encontrándose compuestos
oxidados de lignina como vainillina, ácido vanílico, siringaldehído y ácido
siríngico, que corroboran la naturaleza oxidativa del pretratamiento y la
consecuente deslignificación de los materiales lignocelulósicos.
Con el fin de demostrar el efecto negativo que tiene la presencia de
lignina sobre las celulasas en la hidrólisis del material lignocelulósico, se
aislaron las ligninas (milled wood lignin, MWL) de diferentes materias
primas (eucalipto, paja de trigo y pícea), y se estudió su efecto en la
adsorción y consecuente inhibición de las celulasas (tanto sobre el cóctel
enzimático, como sobre la enzima purificada) mediante microbalanza de
cristal de cuarzo y resonancia de plasmón superficial. Los resultados al
aplicar las celulasas sobre films recubiertos de dichas ligninas demostraron
que la enzima purificada muestra menor afinidad a la adsorción sobre el
film con lignina y mayor reversibilidad de unión. También se observó que
la afinidad más alta en la adsorción lignina-enzima se produce en la lignina
de pícea (99% unidades G) mientras que la adsorción más baja se produjo
en la de eucalipto (70% unidades S). | es |