Activación de factores de crecimiento para fibroblastos por glicosaminoglicanos: Síntesis, estructura y actividad biológica de oligosacáridos de la región regular de la heparina

Abstract

Esta Tesis Doctoral se incluye dentro de un proyecto de investigación cuyo objetivo es contribuir al establecimiento del papel que desempeña la heparina en el mecanismo de activación de los Factores de Crecimiento para Fibroblastos (FGF’s). En esta memoria se presenta una estrategia sintética flexible y eficaz para la obtención de oligosacáridos cuya estructura responde a la región regular de la heparina. La síntesis de estos fragmentos oligosacarídicos con un elevado grado de pureza ha permitido su utilización en estudios estructurales y de actividad biológica, esenciales para el establecimiento de la naturaleza de las interacciones carbohidrato-proteína en este complejo mecanismo de activación. La memoria de esta Tesis Doctoral se ha dividido en cinco capítulos. En el capítulo 1 se revisa la bibliografía existente sobre el tema, desde el punto de vista biológico, sintético y estructural. En el segundo capítulo se presenta el objetivo de esta Tesis: la obtención de oligosacáridos de la región regular de la heparina como el hexasacárido I y el octasacárido II. El capítulo 3 se dedica a la discusión de resultados, incluyendo el análisis retrosintético, la síntesis de las sustancias de partida y la descripción de la ruta sintética empleada en la preparación de los oligosacáridos I y II. Además; en el apartado 3.12 se introduce el estudio estructural de I en disolución y en el apartado 3.13 se recogen los resultados de los ensayos biológicos realizados en las moléculas I y II en el Centro de Investigaciones Biológicas (CIB, CSIC). En el cuarto capítulo se enumeran las conclusiones de esta Tesis Doctoral. Por último en el capítulo 5 se recoge la parte experimental del trabajo. El trabajo presentado en esta Tesis Doctoral se enmarca dentro de un proyecto de investigación cuyo objetivo es contribuir al establecimiento, a nivel molecular, del mecanismo de activación de los Factores de Crecimiento para Fibroblastos (FGF’s). La implicación de esta familia de proteínas en importantes procesos biológicos, como la división y diferenciación celular, confiere al conocimiento preciso de este mecanismos una importancia vital para el futuro desarrollo de fármacos que controlen el amplio número de patologías relacionadas con los FGF’s. Como se ha explicado en el capítulo anterior, la activación de los FGF’s implica la participación de dos tipos de receptores: los receptores de alta afinidad, que son proteínas transmembranales con actividad de tirosina-quinasa; y los receptores de baja afinidad, que son glicosaminoglicanos de tipo heparina o sulfato de heparano que se encuentran en la membrana celular o en la matriz extracelular. Al revisar la bibliografía existente sobre el tema, se concluye que las interacciones altamente específicas entre los FGF’s y los receptores de baja afinidad constituyen una etapa clave en el mecanismo de activación. En otras palabras, es necesaria la participación de glicosaminoglicanos de tipo heparina para activar los FGF’s y que su correspondiente señal se transmita a través de la membrana celular. Para contribuir a establecer el papel que desempeña las cadenas de heparina en este proceso, es importante disponer de fragmentos oligosacarídicoscon un alto grado de pureza. La utilización de estos oligosacáridos en estudios de actividad biológica y reconocimiento molecular debe proporcionar información acerca de los requerimientos estructurales mínimos necesarios para activar a los FGF’s y sobre la naturaleza de las interacciones carbohidrato-proteína en este complejo sistema. Como se ha mencionado en el capítulo anterior, la síntesis química se presenta como la única herramienta disponible para la obtención de estos fragmentos oligosacarídicos, evitando así las modificaciones estructurales y la heterogeneidad inherente a los fragmentos que proceden de la despolimerización parcial de la heparina natural. El objetivo de la presente Tesis Doctoral es establecer una estrategia sintética eficaz para la obtención de oligosacáridos de tipo heparina que responden a la región regular de la misma. Dicho esquema debe ser lo suficientemente versátil como para ser susceptible de sufrir modificaciones para producir otros fragmentos con diferente estructura y patrón de sulfatación. El hecho de dirigir nuestros esfuerzos sintéticos, en primer lugar, hacia la región regular de la heparina se justifica atendiendo a los resultados recogidos en la bibliografía, donde se apunta como hipótesis la participación de estas regiones altamente cargadas en la activación del Factor de Crecimiento para Fibroblastos Ácido (FGF-1), miembro de la familia de los FGF’s sobre el que centramos nuestra atención, debido a nuestra colaboración con el grupo del Profesor Dr. Guillermo Giménez Gallego (Centro de Investigaciones Biológicas, C.I.B., Madrid. En la figura 7 se recogen las estructuras de dos moléculas objetivo cuya síntesis total se detalla en la presente memoria. Se trata del hexasacárido I y del octasacárido II que responden a la estructura de la región regular de la heparina, constituida por la repetición del disacárido trisulfatado GlcNSO3-(6-OSO3)-α(1→4)-IdoA-(2-OSO3) unidos entre sí mediante enlaces glicosídicos α(→4). La obtención de estas estructuras supone la resolución de diversos problemas adicionales a los que ya conlleva la síntesis de oligosacáridos en disolución, como, por ejemplo, la obtención de sintones de ácido L-idurónico en cantidad suficiente para ser utilizados como producto de partida y el manejo, caracterización y purificación de las moléculas finales, altamente cargadas. Una vez comentado el proceso de síntesis de estas estructuras, se resumirán también en esta memoria los primeros estudios de actividad biológica (desarrollados en el Centro de Investigaciones Biológicas, CIB, de Madrid) y químico-estructurales (desarrollados en nuestro grupo de investigación realizados con estos oligosacáridos sintéticos I y II. El trabajo presentado en esta memoria establece una estrategia sintética flexible y eficaz y aporta datos de importancia acerca de la longitud mínima y el patrón de sulfatación que debe poseer las cadenas de heparina para activar convenientemente a los FGF’s. CONCLUSIONES 1. Se describe una estrategia sintética para la obtención de oligosacáridos cuya estructura responde a la región regular de glicosaminoglicanos de tipo heparina. Estos glicosaminoglicanos naturales están constituidos por unidades disacarídicas de D-glucosamina y ácido L-idurónico, unidos por enlaces glicosídicos α(→), que contiene típicamente grupos sulfato en las posiciones 2 y 6 de la unidad d D-glucosamina y 2 de la unidad de ácido L-idurónico. 2. La eficacia de la estrategia sintética descrita en esta Memoria se ilustra con la síntesis del hexasacárido I y el octasacárido II, pero es suficientemente general y versátil como para permitir la síntesis de fragmentos oligosacarídicos de distinta longitud y con diferente distribución de cargas. 3. La estrategia que conduce a los oligosacáridos I y II es una aproximación sintética por bloques n+2 altamente convergente que se basa en unidades discarídicas de tipo V con una distribución de grupos protectores tal que permite: su utilización como unidades donadoras y como unidades aceptoras de glicosilo, la generación del enlace glicosídico con la estereoquímica deseada y la introducción de los grupos sulfato en las posiciones deseadas en estadios posteriores del proceso sintético. 4. La preparación de las unidades disacarídicas básicas de tipo V, que constituyen los bloques sintéticos clave de todo el esquema desarrollado en esta Memoria, se preparan de modo directo y sencillo a partir de donadores de glicosilo derivados de la 2-azido-2-desoxi-D-glucopiranosa y aceptores derivados del ácido L-idurónico en reacciones de glicosidación estéreo- y regioselectivas que aprovechan la mayor reactividad del hidroxilo en posición 4 de la unidad aceptora. 5. Se ha puesto a punto un método de purificación y caracterización de oligosacáridos sintéticos altamente cargados, como I y II, que hace uso de la cromatografía de exclusión molecular, la cromatografía de intercambio iónico y la espectrometría de masas MALDITOF. 6. Se ha llevado a cabo un estudio sobre la estructura tridimensional en solución de hexasacárido I utilizando espectroscopía de RMN y modelización molecular. Este estudio ha puesto de manifiesto algunos aspectos importantes de las características estructurales que siguen siendo materia de investigación y debate en los glicosaminoglicanos naturales como son el equilibrio conformacional de las unidades de ácido L-idurónico y el tipo de movilidad de la molécula. La estructura tridimensional deducida de este análisis, en forma de hélice a derechas, indica que el producto sintético I se comporta como sus análogos naturales y es, por tanto, un buen modelo estructural de la región regular de la heparina. 7. Se presentan datos sobre la estimulación de la actividad mitogénica del Factor de Crecimiento Ácido para Fibroblastos (FGF-1) por el hexasacárido I y el octasacárido II. Estos datos ponen de manifiesto que los dos oligosacáridos estimulan la actividad mitogénica de FGF-1 requiriéndose concentraciones elevadas del hexasacárido I y pequeñas concentraciones del octasacárido II para producir un efecto similar a la heparina. Estos resultados indican claramente que, en cuanto a tamaño y distribución de cargas, el octasacárido II presenta los requisitos estructurales mínimos para la activación. 8. Se presentan datos de análisis de equilibrio de sedimentación que sugieren que la estimulación del efecto mitogénico de FGF-1 por el hexasacárido I y el octasacárido II no implica necesariamente la dimerización de la proteína.