Aislamiento, caracterización y estandarización del extracto del polen de doce variedades de Olea europea

Abstract

Siguiendo la línea de investigación iniciada hace varios años en nuestro Servicio, hemos realizado el aislamiento, caracterización y estandarización del extracto de polen de doce variedades de Olea europea: alameño, aloreña, azuejo, blanqueta, budiego, callosina, manzanilla, negral, picual, rapasaya, zarzariego y zorzaleña. El método de recolección utilizado es válido para su estudio y análisis posterior, ya que hemos obtenido el 98-99% de pureza. Los antígenos mayores del polen de Olea europea presentan unos pesos moleculares por SDS-PAGE de 17000, 19000 y 42000 daltons, aproximadamente, presentando estas bandas proteicas gran fijación de IgE mediante Immunobloting y un punto isoeléctrico de 5,5, obteniendo en el Isoelectroenfoque. En todas las variedades estudiadas se han encontrado tres grupos de fracciones distintas, obtenidas mediante cromatografía por filtración en gel; la primera corresponde a moléculas con gran peso molecular, de dudosa procedencia proteica, la segunda corresponde a la zona de proteínas alergénicas y la tercera está representada por moléculas de muy bajo peso, moléculas que interpretamos como materiales no inmunológicos y de degradación enzimática. El 75% de las variedades presentan una fracción antigénica entre 10000 y 14000 daltons. Las técnicas utilizadas: SDS-PAGE, IEF, cromatografía HPLC de par iónico en fase reserva y cromatografía por filtración en gel son válidas para obtener la huella específica de cada variedad. Aislamos las fracciones alergénicas del extracto de polen de manzanilla, debido a su alto grado de alergenicidad obtenido por tests cutáneos y a su importancia agronómica en nuestra región. Interpretamos que el antígeno mayor de dicho polen se encuentra en la fracción número 2 obtenida mediante cromatografía por filtración en gel. CONCLUSIONES 1. Basándonos en el grado de pureza obtenido en todos los extractos alergénicos estudiados, podemos afirmar que el método de recolección de polen de Olea europea utilizado, es válido para su estudio y análisis. 2. Los antígenos mayores del polen de Olea europea, presentan pesos moleculares por SDS-PAGE, aproximadamente 17000, 19000 daltons y en menor frecuencia en 41000-42000 daltons. 3. El punto isoeléctrico del antígeno mayor, determinado por IEF, se encuentra alrededor de 5,5, al estar presente en el 91% de los extractos estudiados, apoyando los datos bibliográficos existentes. 4. Mediante Rast de inhibición, no existe diferencias significativas, en cuanto a potencial alergénico entre las variedades zorzaleña, rapasaya y alameño. 5. Existen diferencias significativas en el comportamiento alergénico, medido mediante immunoblotting, de las dos variedades del polen de Olea europea analizadas, dividiéndose en tres grupos: las de mayor alergenicidad representadas por las variedades picual, negral, zarzariego, alameño, azuejo y rapasaya; las de moderada alergenicidad representada por budiego, blanqueta y manzanilla, de escasa alergenicidad como aloreña, callosina y zorzaleña. 6. El 75% de las variedades del polen de olivo estudiadas, presentan a nivel de peso molecular aproximadamente de 17000, 19000 y 42000 daltons, bandas proteicas con gran fijación de la IgE, mediante immunoblotting, que correspondería a la localización de los antígenos mayores del polen de olivo. 7. La cromatografía HPLC de par iónico en fase reversa, muestra un piso de elución a un tiempo de retención de 33 y 34 minutos en las doce variedades del polen de Olea europea, que podría corresponder al antígeno mayor de dicho polen. 8. La cromatografía por filtración en gel, es una técnica útil para conocer la huella específica de especie del polen de olivo, así como para identificar las distintas variedades. 9. En todas las variedades estudiadas se encuentran tres grupos de fracciones distintas, obtenidas mediante cromatografía por filtración en gel, la primera correspondiente a moléculas con un gran peso molecular, de dudosa procedencia proteica, la segunda que corresponde a la zona de proteínas alergénicas y la tercera representada por moléculas de muy bajo peso molecular, correspondiente a materiales no inmunológicos y de degradación enzimática. 10. EL 75% de las variedades analizadas del polen de olivo, presentan una fracción proteíca a nivel de 10000-14000 daltons, obtenidos mediante cromatografía de filtración en gel. 11. La variedad de la manzanilla presentan un alto grado de alergenicidad medido por tests cutáneos. 12. Aunque es posible la pérdida de proteínas alergénicas tras múltiples procesos de caracterización y de purificación, sospechamos la localización del antígeno mayor del polen de manzanilla en la fracción número 2 obtenida por cromatografía de filtración en gel. La hipersensibilidad al polen de Olea europea es muy frecuente en el área mediterránea. Es una causa importante de enfermedad alérgica y se estima que corresponde entre el 30-70% de la polinosis en el sur de España. Debido al interés e importancia de conocer y aislar los alérgenos mayores y menores del polen de olivo, mediante su caracterización y posterior estandarización y, por otra parte, conociéndose que existe una mejor respuesta clínica a la inmunoterapia con extractos alergénicos purificados, así como una mayor reducción de los riesgo de los efectos colaterales severos e inesperados, algunos grupos de investigación, principalmente de nuestro país, se han dedicado a su estudio en la última década. Por otra parte es fundamental estandarizar los extractos alérgicos para disminuir la variabilidad de lote a lote de extracto, eliminar impurezas y sustancias que producen reacciones inespecíficas en los tests diagnósticos y, por tanto, el correcto diagnóstico y tratamiento de los enfermos atópicos. Basándonos en este hecho, hemos creído conveniente el estudio en profundidad de este polen y, por ello, desde hace años viene siendo una de nuestras líneas de investigación la purificación caracterización y estandarización de las distintas variedades del polen de olivo. El objetivo del presente trabajo será, pues, investigar acerca de posibles cualidades y características alergénicas diferenciales, entre los pólenes pertenecientes a distintos cultivares de Olea europea presentes en nuestra región y tendrá la finalidad intentar buscar la variedad más alergénica y, en otro sentido, la purificación y el aislamiento de las fracciones alergénicas y antígenos mayores para su utilización en el tratamiento de los enfermos afectos de polinosis. Tras los primeros resultados obtenidos en este estudio, realizado en nuestro departamento en los primeros años de la década de los 80, escogemos la manzanilla del Aljarafe, para comenzar su purificación y el aislamiento de sus antígenos mayores por las siguientes razones. 1. Por presentar el 70% de la población sensible a la Olea europea test cutáneo positivo a la manzanilla del Aljarafe. 2. Por obtenerse un 33,01% sobre la radiactividad total en el RAST directo a dicho polen. 3. Por corresponder a una de las variedades más extendidas y características de nuestra región.