Aplicación de técnicas moleculares basadas en ADN y ARN al estudio de la diversidad microbiana en la cueva de Altamira (Cantabria, España)

Abstract

La hipótesis de trabajo de esta Tesis Doctoral asume que las comunidades microbianas de la cueva de Altamira son altamente complejas y desconocidas. Existen diversas evidencias que fundamentan esta hipótesis, como el estudio preliminar de Schabereiter-Gurtner et al., (2002a) en la cueva de Altamira y trabajos de otras cuevas (Schabereiter-Gutner et al., 2002b, 2004; Northup et al., 2003). Por otra parte, probablemente, una fracción elevada de esos organismos podría no ser metabólicamente activa bajos las condiciones concretas de la cueva de Altamira y por tanto podrían no desempeñar un papel significativo en el ecosistema, aún cuando sean capaces de crecer en medios de cultivo. La existencia de microorganismos en estado latente en comunidades microbianas naturales ha sido citada en numerosas ocasiones (Madigan et al., 2000). Idealmente, la detección de miembros metabólicamente activos de una comunidad microbiana permitiría enfocar el estudio en aquellos microorganismos que participan directamente en los procesos de alteración de los sustratos. La determinación de los miembros activos de las comunidades microbianas de la cueva de Altamira puede llevarse a cabo a través de análisis del ARN de dicha comunidad, mientras que el ADN proporcionaría información sobre el total de microorganismos presentes. En este trabajo se plantea la necesidad de diseñar nuevos procedimientos de análisis de comunidades microbianas y por tanto, se presentarán métodos destinados a facilitar dichos estudios. Este estudio se ha enfocado en el análisis de las comunidades microbianas que se desarrollan en la cueva de Altamira, centrándose fundamentalmente en aquellas colonizaciones observadas en la cueva. Para ello, se han aplicado algunas de las técnicas más recientes e incluso se han propuesto nuevas estrategias de trabajo. Específicamente, los objetivos planteados son los siguientes: - Análisis de las comunidades microbianas en base al ADN. Correspondiente a los microorganismos presentes en la cueva de Altamira. Análisis de las comunidades microbianas en base al ARN que correspondería a aquellos microorganismos que presentan una mayor actividad metabólica en el punto muestreado. - Comparación de las comunidades microbianas presentes y metabólicamente activas. - Comparación de las distintas comunidades microbianas estudiadas y que constituyen los tipos principales de colonizaciones y formaciones geobiológicas observadas en la cueva de Altamira. - Determinación de los grupos microbianos más característicos de las comunidades microbianas analizadas. - Análisis global de la diversidad microbiana existente en la cueva de Altamira. Este estudio presenta diversos análisis de la microbiología de la cueva de Altamira, fundamentalmente, enfocado en la diversidad existente en esta cueva. Aunque el interés del proyecto tiene consecuencias importantes para el diseño de líneas de conservación de la cueva de Altamira, no es propósito de este trabajo el plantear dichas estrategias. De acuerdo con el convenio vigente entre el Ministerio de Cultural Español y el CSIC, la divulgación y evaluación del estado de conservación y planificación futura para la cueva de Altamira no es competencia de los investigadores del CSIC participantes en estas investigaciones. Los resultados obtenidos en este trabajo han llevado a las siguientes conclusiones básicas: - Las distintas comunidades microbianas pueden ser caracterizadas por perfiles moleculares los cuales han podido ser comparados gracias a un nuevo método estadístico diseñado durante este estudio. - Las comunidades microbianas presentes en la cueva de Altamira y las comunidades metabólicamente activas han podido ser analizadas en base al ADN y al ARN, respectivamente. - Se han determinado los microorganismos más característicos que forman parte de las colonizaciones de distintas coloraciones observadas en la cueva de Altamira. Entre los microorganismos metabólicamente activos, la división Proteobacteria es la más representativas destacando Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Deltaproteobacteria y Betaproteobacteria, en orden de abundancia. Otros grupos importantes fueron las Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes y Planctomycetes. - Las comunidades metabólicamente activas representan menos de un 60% de las comunidades presentes en la cueva de Altamira, por lo que existe un porcentaje importante de microorganismos que pudieran estar en espera de cambios en su entorno lo que podría suponer consecuencias impredecibles para la conservación de la cueva. Entre estos microorganismos destacan los grupos bacterianos de Actinobacteria, Firmicutes. - Una gran diversidad de Crenarchaeota de baja temperatura se encuentra metabólicamente activa en la cueva de Altamira, aunque las consecuencias de su desarrollo en este ambiente son actualmente desconocidas. - Las bacterias reductoras de sulfato representan un grupo fisiológico característico muy diverso y metabólicamente activo en la cueva de Altamira lo que puede presentar riesgos para la conservación de las pinturas. - En la cueva de Altamira existe una gran variedad de microorganismos diferentes, muchos de los cuales han sido detectados como metabólicamente activos, y cuya presencia no había sido detectada previamente en cuevas con pinturas rupestres. Entre estos grupos destacan miembros de Crenarchaeota, Nitrospira, Firmicutes, Gemmatimonadetes, Fusobacteria, Verrucomicrobia y diversas divisiones candidatas. Debido al desconocimiento del metabolismo llevado a cabo por la mayoría de estos grupos, se desconocen sus consecuencias para la conservación de la cueva. - Se ha detectado la presencia de microorganismos fotótrofos, aunque su presencia parece una consecuencia de la iluminación existente en el pasado y representan un indicativo del riesgo potencial existente si la iluminación se reestableciese en esta cueva. - La presencia de hongos en la cueva de Altamira parece estar reducida a esporas ya que no se han detectado por métodos moleculares y sí en cultivos. El equilibrio actual de as comunidades microbianas podría estar limitando su proliferación en esta cueva. - La cueva de Altamira presenta una diversidad microbiana muy elevada, muy superior a la que ha podido ser detectada en este estudio. Este hecho unido al desconocimiento del metabolismo de muchos de los microorganismos detectados sugiere la necesidad de continuar este tipo de estudios, así como el desarrollo de nuevos métodos de trabajo para la detección y el cultivo de microorganismos.